青霉素結(jié)合蛋白與細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺抗生素的抗藥性機(jī)理

時(shí)間：2024-09-15 03:41:22 藥學(xué)畢業(yè)論文我要投稿

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　　【論文關(guān)鍵詞】青霉素結(jié)合蛋白　金黃色葡萄球菌　綠膿桿菌; 細(xì)菌細(xì)胞壁　病原菌　點(diǎn)結(jié)合　大腸桿菌

　　【論文摘要】β-內(nèi)酰胺抗生素(如青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)等)可以專(zhuān)一性與細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶位點(diǎn)結(jié)合,干擾細(xì)胞壁肽聚糖合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于靶位點(diǎn)能與同位素標(biāo)記的青霉素G進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,因此將這些靶位點(diǎn)稱(chēng)之為青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBP’s)。一些革藍(lán)氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革藍(lán)氏陽(yáng)性菌能夠產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶,這些酶可以水解青霉素和頭孢菌素等抗生素,而使細(xì)胞具有抵抗這類(lèi)β-內(nèi)酰胺抗生素的殺傷能力。已經(jīng)證明β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生與質(zhì)粒和染色體基因有關(guān)。對(duì)于不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺

　　β-內(nèi)酸胺抗生素(如青霉素類(lèi)和頭抱菌素類(lèi)等)可以專(zhuān)一性與細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶位點(diǎn)結(jié)合，干擾細(xì)胞壁膚聚糖合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于靶位點(diǎn)能與同位素標(biāo)記的青霉素G進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，因此將這些靶位點(diǎn)稱(chēng)之為青霉素結(jié)合蛋白(penieillinbindsng pro-teins，PBP’s)。一些革藍(lán)氏陰性細(xì)菌和少數(shù)革藍(lán)氏陽(yáng)性菌能夠產(chǎn)生多種β一內(nèi)酞胺酶，這些酶可以水解青霉素和頭抱菌素等抗生素，而使細(xì)胞具有抵抗這類(lèi)β一內(nèi)酞胺抗生素的殺傷能力。已經(jīng)證明β一內(nèi)酞胺酶產(chǎn)生與質(zhì)粒和染色體基因有關(guān)。對(duì)于不產(chǎn)生莊內(nèi)酞胺酶的細(xì)菌而言，獲得刀一內(nèi)酞胺抗性的能力是通過(guò)改變抗生素作用的靶位點(diǎn)，其結(jié)果或者減少PBP’5的數(shù)量或者降低PBP‘s對(duì)物的親和力。這種不依賴(lài)刀一內(nèi)酞胺酶而存在的莊內(nèi)酞胺抗性廣泛存在于人類(lèi)病原菌中，而絕大多數(shù)這類(lèi)病原菌是從經(jīng)過(guò)刀一內(nèi)酞胺藥物治療過(guò)的病人中分離出來(lái)的，如許多分離到的綠膿桿菌〔1〕、金黃色葡萄球菌〔2-3〕、流感嗜血桿菌(4-5)、肺炎鏈球菌(6-7)、淋球菌臨(8-9)、屎鏈球菌(10-11)等均具有內(nèi)在的β-內(nèi)酚胺抗性。由于臨床上越來(lái)越多地分離到月耐藥性細(xì)菌，對(duì)于β一內(nèi)酞胺抗生素的:使用目困.提出了挑戰(zhàn)，有關(guān)細(xì)菌對(duì)β一內(nèi)酞胺藥物抗性機(jī)理的研究也就越來(lái)越多地引起人們的重視，這種研究對(duì)發(fā)展新一代抗生素更有效地用于臨床治療具有重要意義。本文主要介紹細(xì)菌內(nèi)在的口一內(nèi)酞胺抗性機(jī)理研究進(jìn)展。

　　一、PBp’S的生物學(xué)特性

　　早在1940年Gardner在觀(guān)察青霉素G對(duì)敏感細(xì)菌作用時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁是β-內(nèi)酞胺抗生素最初攻擊的靶位點(diǎn)，因?yàn)榍嗝顾谿的作用首先是削弱細(xì)胞壁的功能。后來(lái)進(jìn)一步證實(shí)莊內(nèi)酸胺抗生素首先與細(xì)胞膜上的PBP產(chǎn)S結(jié)合，這些PBP’s具有酶活性，參與細(xì)菌細(xì)胞壁膚聚糖的合成。膚聚糖主要負(fù)責(zé)維持細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，生長(zhǎng)在低滲中的細(xì)菌如該結(jié)構(gòu)破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。β一內(nèi)酞胺抗生素與PBP’S結(jié)合，干擾了PBP’s的正常酶功能，使細(xì)胞壁正常合成阻斷。所有檢測(cè)的真細(xì)菌種至少含有3種PBP’S，有些含有8一9種。有關(guān)PBP侶的命名后面將要介紹。對(duì)大腸桿菌的PBP尹S研究得最清楚(12.13.14)。在大腸桿菌中有7種PBP’S，依次為PBPIA、IB產(chǎn)S、2、3、4、5、6。這7個(gè)PBP’S分別受控于10個(gè)不同的染色體遺傳位點(diǎn)。ponA或mrcA決定PBPIA;ponB或mreB控制IB’S;pbpA或mrdA與

　　PBP2產(chǎn)生有關(guān);pbpB或ftsl編碼PBPs;dacB、dacA、dacC三個(gè)遺傳位點(diǎn)分別控制PBP4、5、6。PBPIA分子量92KDa，PBPIB’C由一系列分子量在90KDa范圍的蛋白質(zhì)組成。PBPIA和IB p在體外兼具有轉(zhuǎn)葡糖基酶和轉(zhuǎn)膚基酶活性，這二種酶在細(xì)菌細(xì)胞壁合成中起重要作用，如果PBPIA和IB;S同時(shí)失活則導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解死亡。PBP2分子量為66KDa，在間隔區(qū)(septa)細(xì)胞壁合成時(shí)具有轉(zhuǎn)膚基酶活性，PBPZ失活，細(xì)胞變成球形體不生長(zhǎng)。PBP3的分子量為60KDa，在IBgl隔區(qū)橫壁(eross一wall)合成時(shí)有轉(zhuǎn)葡糖基酶或(和)轉(zhuǎn)膚基酶活性。PBP3突變細(xì)胞變成無(wú)隔膜的絲狀體。PBP4分子量49KDa，具有次級(jí)的轉(zhuǎn)膚基酶、D、D一竣膚酶或D、D一內(nèi)膚酶活性，在膚聚糖成熟中起作用。PBP4變性導(dǎo)致細(xì)胞不能持續(xù)轉(zhuǎn)膚作用。PBPS和6均具有D、D一狡膚酶活性，目前尚未觀(guān)察到對(duì)于這二個(gè)蛋白質(zhì)變性引起的細(xì)菌生理生化反應(yīng)。除上述發(fā)現(xiàn)的7種PBP’S外，用碘代青霉素衍生物又檢測(cè)到一種新的PBP’s，命名為PBPIC，有關(guān)大腸桿菌PBPIC的特點(diǎn)及功能還不清楚(15)。

　　同時(shí)抑制PBP工A與任何一種PBP]B’S，PBPZ或PBP3均導(dǎo)致生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞死亡。所有這些高分子量PBP’S均具有體外轉(zhuǎn)膚基酶活性，除PBP2外，其它均具有轉(zhuǎn)葡糖基酶活性，很明顯，所有這些PBP’s在大腸桿菌細(xì)胞壁或橫壁合成的催化控制中起重要作用，它們是獨(dú)立的刀一內(nèi)酞胺抗生素殺傷靶位點(diǎn)。

　　二、pBP’S分離及純化

　　每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞約含105~104個(gè)PBP’S分子，共分成二類(lèi)，一類(lèi)為含量豐富的低分子量PBP/s，具有D、D一撥膚酶活性，由于含量豐富，這類(lèi)PBP’s很容易純化。第二類(lèi)由一些含量較少的高分子量PBP’S組成，純化比較困難，而且純化的PBP’s在體外常常檢測(cè)不到酶活性。

　　早期用〔)青霉素標(biāo)記敏感細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，青霉素與細(xì)胞膜上少數(shù)高親和力PBP’s形成的復(fù)合物在2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持穩(wěn)定，而且既便有過(guò)剩的非標(biāo)記β一內(nèi)酞胺藥物存在時(shí)也不與標(biāo)記的青霉素發(fā)生取代。PBP’s能與青霉素衍生物進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的特性使得人們能用親和層析方法分離純化這些蛋白質(zhì)，洗脫劑用經(jīng)胺，因?yàn)榻?jīng)胺是轉(zhuǎn)膚基作用的受體，用這種方法可以純化活性pBP’S

　　Spratt和Pardee(16)發(fā)明一種簡(jiǎn)單可重復(fù)性技術(shù)用于PBP’s分離。首先用〔〕一青霉素標(biāo)記膜制備物，并使之飽和，然后用離子去污劑使之變性(主要防止青霉素一PBP復(fù)合物被酶水解)。用SDS聚丙烯酷胺凝膠電泳分離各PBP產(chǎn)s，根據(jù)分子量的遞減或者在SDS一中泳動(dòng)速率遞增命名為，PBPI、2…n。各種細(xì)菌的PBP’s均用此法命名，亞類(lèi)可用A、B、C等。如PBPI又分為PBP一A、1B和1C。

　　在膜制備過(guò)程中有必要保留PBP’s活性。需要說(shuō)明的是，其它的β一內(nèi)酞胺抗生素如甲氧西林(methieillim)、頭抱西丁(Cef-oxitin)、氨葦青霉素以及moxalaetan等也可與膜蛋白結(jié)合，但所有的β一內(nèi)酸胺抗生素的靶位點(diǎn)均位于PBP/s之間，尚未發(fā)現(xiàn)一種只與上述抗生素結(jié)合而不與青霉素結(jié)合的膜蛋白。另外實(shí)驗(yàn)表明，在分離PBP’s時(shí)，用〔〕一青霉素進(jìn)行體外標(biāo)記比〔〕升青霉素專(zhuān)一性更高。

　　三、革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌PBP‘S改變與細(xì)菌內(nèi)在β一內(nèi)酞胺抗性關(guān)系

　　一般講，革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁可自由透過(guò)β一內(nèi)酞胺抗生素，除產(chǎn)生β一內(nèi)酞胺酶菌株，革藍(lán)氏陽(yáng)性菌一般對(duì)青霉素敏感。目前產(chǎn)生β一內(nèi)酞胺酶的菌株在革藍(lán)氏陽(yáng)性菌中主要是葡萄球菌，幾乎所有的金黃色葡萄球菌都產(chǎn)生β一內(nèi)酞胺酶。由于葡萄球菌產(chǎn)生β-內(nèi)酞胺酶，臨床上曾采用甲氧西林取代青霉素，但使用不久就分離到抗甲氧西林的突變株。從英國(guó)、美國(guó)、意大利、澳大利亞、日本等國(guó)分離到的抗甲氧西林金黃色葡萄球菌突變株均發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)共同的但在正常敏感菌株中不存在的PBP，命名為PBP2’ (或PBP2a)(17)，分子量約7sKD。，該蛋白質(zhì)對(duì)廣譜房?jī)?nèi)酞胺抗生素均具有較低的親和力。該P(yáng)BPZ‘在SDS一page中位于野生型PBPZ和3之間。

[1]

　　Brown和Reyoolds(18)研究表明，金黃色葡萄球菌表達(dá)甲氧西林抗性受生長(zhǎng)條件的影響。在較低溫度(30℃)或高滲透壓培養(yǎng)基中抗性增加，在低pH值培養(yǎng)基中抗性降低。菌株13136p一m+在30℃對(duì)所有的莊內(nèi)酞胺抗生素均有抗性，但在40℃則表現(xiàn)正常的敏感型。在30℃培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞膜中出現(xiàn)大量的PBP2’，而40℃生長(zhǎng)的細(xì)胞則缺少這種PBP2’。因此，Brown提出，當(dāng)其它的FBP’s失活后，這種新的低親和力PBP取代了其它PBP’s的功能。PBF2’存在于所有的已檢測(cè)的抗甲氧西林菌株中。除在葡萄球菌中觀(guān)察到PBP’s改變外，在其它抗性菌株中也發(fā)現(xiàn)，如抗鄰氯青霉素(Cloxacillin)枯草芽抱桿菌，相應(yīng)的PBP2a對(duì)該種抗生素的親和力降低。在分離到的青霉素抗性產(chǎn)氣英膜梭菌突變株則降低PBPI對(duì)青霉素的親和力。因此，在不同的革藍(lán)氏陽(yáng)性菌中，β一內(nèi)酞胺抗生素與不同的PBP’s親和力也不同。而有些細(xì)菌表達(dá)這種內(nèi)在的β一內(nèi)酸胺抗性機(jī)理要復(fù)雜得多。例如肺炎鏈球菌，該菌不產(chǎn)生莊內(nèi)酸胺酶。用SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳分離肺炎球菌PBP’s時(shí)發(fā)現(xiàn)敏感型肺炎球菌有5種青霉素結(jié)合蛋白PBPla、lb、2a、2b和3。用同樣方法檢測(cè)耐青霉素菌株的PBP產(chǎn)s發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的PBP’s的生化特性和對(duì)青霉素的親和力均有所改變。耐青霉素菌株的PBPla和1b完全喪失與青霉素的親和力，出現(xiàn)一種新的分子量較小的PBPlc。另外耐菌株的2b也被一種新的分子量接近于2a的PBP2a產(chǎn)所代替。為進(jìn)一步研究PBP’s與抗藥性之間的關(guān)系。Zighelboim等〔田分離野生型耐青霉素肺炎球菌8249DNA轉(zhuǎn)化敏感型肺炎球菌受體菌R6。經(jīng)多次轉(zhuǎn)化獲得一系列耐藥水平不同的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化結(jié)果說(shuō)明，菌株8249的高耐藥(對(duì)青霉素)特征不能通過(guò)一次轉(zhuǎn)化傳給R6。而需要進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化才能使R。逐漸獲得較高的抗性性狀。Shoekley等〔20〕以及其它的研究者對(duì)肺炎球菌耐藥機(jī)理研究也得出相同的結(jié)果。目前對(duì)于肺炎球菌有多少遺傳因子與抗藥性有關(guān)還不清楚，但多重轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)逐步獲得高水平耐藥性轉(zhuǎn)化子說(shuō)明野生型菌株8249攜帶有多重突變的遺傳因子，抗藥性是受多基因控制，那么受體菌需要吸收多個(gè)DNA分子以滿(mǎn)足細(xì)胞獲得高水平抗性的需要。這種需要多次轉(zhuǎn)化逐步獲得較高的抗性水平的現(xiàn)象在金黃色葡萄球菌中也得到證實(shí)(17)。

　　從上述研究不難看出，在革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌抗性菌株中新出現(xiàn)的低親和力PBP’s阻止了β內(nèi)酞胺抗生素對(duì)細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)其它的PBP’s由于抗生素結(jié)合而失去活性時(shí)，這些低親和力PBPs可以補(bǔ)償其它PBP’s的功能。另外，在抗性菌株中，相應(yīng)的PBP’s從高抗生素親和力向低親和力方向改變，肺炎鏈球菌PBP’s改變是說(shuō)明這類(lèi)問(wèn)題最好的例子。

　　四、革藍(lán)氏陰性細(xì)菌PBP’s改變與細(xì)菌內(nèi)在β一內(nèi)耽胺抗性關(guān)系

　　革藍(lán)氏陰性細(xì)菌的外膜穿透能力變化較大，一般在奈瑟氏菌中較高，在假單抱菌中較低，而腸道菌處于中間水平。多數(shù)革藍(lán)氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生介內(nèi)酞胺酶，這些酶能水解青霉素類(lèi)、頭抱菌素類(lèi)等類(lèi)抗生素�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腸道菌、25%的流感嗜血桿菌、擬桿菌、假單胞菌、淋球菌、粘膜炎布蘭漢氏球菌均產(chǎn)生莊內(nèi)酞胺酶。

　　對(duì)不產(chǎn)生β-內(nèi)酞胺酶但具有青霉素抗性的淋球菌分析表明，有6個(gè)遺傳位點(diǎn)PenA、mtr、penB、peln、tem、env控制菌株內(nèi)在的莊內(nèi)酞胺抗性〔20，“‘’。penA基因?qū)Ｒ恍詻Q定低水平青霉素抗性，mtl~基因本身除增加對(duì)青霉素抗性外還與其它的抗生素抗性有關(guān)，tem和pen基因本身沒(méi)有可表達(dá)的性狀，但轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明，這二個(gè)基因攜同其它三個(gè)基因一道可以提高菌株對(duì)青霉素的抗性，env基因突變則削弱青霉素抗性表達(dá)。

　　Dougherty等發(fā)現(xiàn)，青霉素抗性淋球菌首先降低PBPZ對(duì)青霉素的親和力，然后降低PBPI的親和力，降低PBPI的親和力可使菌株獲得較高水平的青霉素抗性，當(dāng)然這一作用同時(shí)受其它基因位點(diǎn)的調(diào)節(jié)。penA與降低PBP2的親和力有關(guān)。

　　從臨床接受呱拉西林(piperaeillin)治療的患者體內(nèi)分離到的β一內(nèi)酞胺抗性M型和K型綠膿桿菌，發(fā)現(xiàn)PBP’s改變可以增加菌株對(duì)戶(hù)內(nèi)酞胺抗性水平。在低水平抗性K型綠膿桿菌中，PBP3或者缺少，或者喪失對(duì)青霉素的結(jié)合能力。中等水平抗性的M型綠膿桿菌菌株則降低所有的PBPs對(duì)青霉素的結(jié)合能力。另外，從一起淋球菌暴發(fā)流行中分離到帶有penA、mtr、penB以及tet基因突變的菌株，這些菌株除改變相應(yīng)的PBP’s對(duì)青霉素的親和力外，還缺少一種正常的外膜蛋白(22)。

　　對(duì)三株具有內(nèi)在莊內(nèi)酸胺抗性但不產(chǎn)生β-內(nèi)酞胺酶的流感嗜血桿菌分析指出，這些抗性菌株的抗藥性是由多重因子決定的，而且細(xì)胞通透性改變同時(shí)引起外膜蛋白改變，并降低PBP3、6或3、4或4對(duì)青霉素的親和力。

[2]

　　在某些革藍(lán)氏陰性細(xì)菌中，改變一種或多種PBPs兼有影響抗生素穿透外膜的功能。已知在革藍(lán)氏陰性細(xì)菌中β一內(nèi)酞胺抗生素進(jìn)入細(xì)胞是通過(guò)專(zhuān)一性的porin通道，在大腸桿菌突變株研究中證明，外膜蛋白。nZpC和ompF缺陷會(huì)導(dǎo)致菌株的低水平戶(hù)內(nèi)酞胺抗性(24-25)。細(xì)菌對(duì)于β一內(nèi)酞胺抗生素的內(nèi)在抗性機(jī)理主要通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的物作用點(diǎn)發(fā)生改變，降低或失去抗生素與作用點(diǎn)的結(jié)合能力，干擾或阻斷藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。在細(xì)菌中廣泛存在著PBP‘s改變導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)在的β一內(nèi)酸胺抗性現(xiàn)象可以使人們分離純化這些PBPs，研究其生理生化特性及構(gòu)象改變與抗性的關(guān)系，創(chuàng)造新一代能夠與這些改變的PBP’s有效結(jié)合的β一內(nèi)酞胺抗生素類(lèi)。同時(shí)也可以改造現(xiàn)有的抗生素，或采用戶(hù)內(nèi)酞胺抗生素的混合物攻擊不同的PBP’s以達(dá)到殺傷細(xì)菌的目的。對(duì)于那些產(chǎn)生β一內(nèi)酞胺酶的細(xì)菌而言，將莊內(nèi)酸胺抗生素與莊內(nèi)酞胺酶抑制劑棍合使用也是解決細(xì)菌莊內(nèi)酞胺抗性問(wèn)題的一種途徑。

　　為達(dá)到有效地殺傷病原菌，一定要控制濫用抗生素的現(xiàn)象，另外根據(jù)不同地區(qū)病原微生物流行特點(diǎn)使用不同的治療途徑是十分必要的。

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