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中醫(yī)學(xué)論文開(kāi)題報(bào)告范文
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論文題目：連花解毒顆粒急性毒性及解熱實(shí)驗(yàn)研究
一、課題研究的目的與意義、國(guó)內(nèi)外研究的發(fā)展概況和趨勢(shì)
1、課題研究的目的與意義
連花解毒顆粒由金銀花、牛蒡子、蘆根等多味中藥提取制成，該處方是我院中醫(yī)科專家長(zhǎng)期在臨床使用的驗(yàn)方，具有清熱解毒，涼血利咽，宣肺化痰，止咳平喘的功效。臨床適用于風(fēng)熱感冒，溫病初起，流感、上呼吸道感染、咽炎、支氣管炎、腮腺炎、斑疹等病癥治療[1-5]。中醫(yī)理論認(rèn)為：由于風(fēng)熱之邪犯表，則熱郁肌膚腠理，衛(wèi)表失和，故見(jiàn)身熱較著，微惡風(fēng)，汗泄不暢等癥;風(fēng)熱上擾則頭脹痛;風(fēng)熱之邪上犯則咽燥或咽喉紅腫疼痛，口渴欲飲、鼻塞、流黃濁涕。中醫(yī)的“毒”含義甚廣，清熱解毒中藥所解之的“毒”為火熱壅盛所致的“熱毒”及“火毒”，主要用于溫?zé)岵〖盁岫緹胧Y。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，清熱解毒中藥所解之“毒”不僅包括“外源性之毒”(細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素)，還包括氧自由基和細(xì)胞因子過(guò)度釋放等“內(nèi)源性之毒”[6]。連花解毒顆粒所含主藥均為清熱解毒中藥的典型代表，利用動(dòng)物發(fā)熱模型對(duì)發(fā)熱過(guò)程進(jìn)行模擬，從而對(duì)解熱作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。本課題還對(duì)藥物的急性毒性進(jìn)行了考察，為臨床安全用藥提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
2、國(guó)內(nèi)外研究的發(fā)展概況和趨勢(shì)
目前，國(guó)內(nèi)外研究藥物急性毒性的方法有很多，經(jīng)典的有半數(shù)致死量試驗(yàn)(50%lethaldose，LD50)、最大給藥量試驗(yàn)等，除此之外，還有限量試驗(yàn)、近似致死劑量實(shí)驗(yàn)、擴(kuò)展試驗(yàn)、固定計(jì)量法、劑量累積試驗(yàn)等。中藥新藥中應(yīng)用最多的是半數(shù)致死量和最大給藥量試驗(yàn)�！吨兴帯⑻烊凰幬锛毙远拘匝芯考夹g(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定未在國(guó)內(nèi)上市的由中藥、天然藥物組成的非注射給藥的復(fù)方制劑，如該復(fù)方制劑處方組成符合中醫(yī)藥理論，有一定的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，一般情況下，可采用一種動(dòng)物，按臨床給藥途徑進(jìn)行急性毒性反應(yīng)的觀察。本課題選用嚙齒類(lèi)動(dòng)物小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用口服給藥方式，對(duì)連花解毒顆粒進(jìn)行急性毒性反應(yīng)的研究。發(fā)熱是清熱藥最主要的適應(yīng)癥之一，解熱作用是清熱藥的一個(gè)重要共性。在實(shí)驗(yàn)中可以采用多種方法來(lái)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)熱，如細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物、造成無(wú)菌炎癥、化學(xué)藥物、刺激丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞及暴露于高熱壞境等，這些發(fā)熱模型均可用于解熱實(shí)驗(yàn)研究，如目前國(guó)內(nèi)外常用的有注射腐化枯草浸液、角叉菜膠、牛乳或蛋白胨、加熱殺死的革蘭陰性菌(大腸桿菌、傷寒或副傷寒桿菌、痢疾桿菌)菌液、傷寒副傷寒菌苗、啤酒酵母、2,4—二硝基苯酚等發(fā)熱方法研究中藥的解熱作用。為了進(jìn)行機(jī)制分析或特殊研究目的，還可選用內(nèi)生致熱原生成及發(fā)熱試驗(yàn)、微量PGE腦室內(nèi)或下丘腦注射致熱試驗(yàn)、LipidA、IL-1、干擾素及TNF性發(fā)熱試驗(yàn)等[7]。本課題選用嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，擬采用角叉菜膠為發(fā)熱模型致熱源，皮下注射可于局部產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，此炎癥的形成主要與其誘導(dǎo)前列腺素生物合成及釋放有關(guān)，可引起一個(gè)持續(xù)炎癥反應(yīng)，并激活巨噬細(xì)胞引發(fā)發(fā)熱。因其來(lái)源不同，其致熱作用有些差異，故于正式實(shí)驗(yàn)前宜先做預(yù)試驗(yàn)，以選擇適宜的種類(lèi)、濃度與劑量，此外在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段觀察大鼠體溫變化全過(guò)程。
二、主要研究?jī)?nèi)容
本課題采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠和小鼠以口服給藥方式，對(duì)連花解毒顆粒進(jìn)行以下兩個(gè)方面進(jìn)行研究：
(一)連花解毒顆粒急性毒性反應(yīng)的研究
(二)連花解毒顆解熱藥效學(xué)的研究
三、主要研究方案
1、連花解毒顆粒的急性毒性實(shí)驗(yàn)
中藥新藥審評(píng)的技術(shù)要求規(guī)定，當(dāng)受試藥物的毒性很低，或者因濃度或體積的限制，無(wú)法測(cè)出LD50時(shí)，可僅提供最大給藥量試驗(yàn)的結(jié)果,測(cè)定其能達(dá)到人用量的多少倍，對(duì)藥物安全性進(jìn)行評(píng)估，以耐受人用量口服100倍以上為安全[8]。
1.1溶液的配制與預(yù)實(shí)驗(yàn)
1.1.1溶液的配制連花解毒顆粒供試品1的制備：取連花解毒顆粒125.0g溶于100mL水中，攪拌均勻即得混懸藥液，此作為連花解毒顆粒供試品1溶液(相當(dāng)于人臨床用量100倍)。連花解毒顆粒供試品2的制備：取連花解毒顆粒188.0g溶于100mL水中，攪拌均勻即得混懸藥液，此作為連花解毒顆粒供試品2溶液。
1.1.2預(yù)實(shí)驗(yàn)方法：
1.1.2.1選擇體重約20g的健康小鼠10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h。每只小鼠按100g/kg/d量于12h內(nèi)給予灌胃供試品1溶液2次，灌胃體積為0.4mL/10g，給藥后連續(xù)觀察7天。如果小鼠全部存活，則采用最大給藥量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果小鼠部分或全部死亡則采用LD50的測(cè)定。1.1.2.2選擇體重約20g的健康小鼠10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h。每只小鼠按150g/kg/d量于12h內(nèi)給予灌胃供試品2溶液2次，灌胃體積0.4mL/10g，給藥后連續(xù)觀察7天。
1.2最大給藥量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
選擇體重約20g的健康小鼠48只，雌雄各半，分成兩組，每組24只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠按150g/kg/d量于12h內(nèi)給予灌胃連花解毒顆粒供試品2溶液2次，灌胃體積為0.4mL/10g。對(duì)照組每只小鼠給以生理鹽水，一天兩次，灌胃體積為0.4mL/10g。兩組小鼠給藥后連續(xù)觀察14天。期間若有死亡小鼠即刻尸解，肉眼觀察小鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎等)的變化，若肉眼可見(jiàn)異常則進(jìn)行病理檢查。若無(wú)14天后處死全部存活小鼠，解剖和尸檢內(nèi)臟器官有無(wú)異常。并記錄14天內(nèi)雌雄小鼠的行為活動(dòng)、被毛、皮膚、呼吸、大小便、食欲，鼻、眼、口腔有無(wú)異常分泌物等情況(見(jiàn)附錄Ⅰ)。根據(jù)公式計(jì)算出其能達(dá)到人用量的多少倍[9~11].150g/kg/d量于12h內(nèi)給予灌胃供試品2溶液2次，灌胃體積為0.4mL/10g，給藥后連續(xù)觀察7天。1.2最大給藥量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)選擇體重約20g的健康小鼠48只，雌雄各半，分成兩組，每組24只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠按150g/kg/d量于12h內(nèi)給予灌胃連花解毒顆粒供試品2溶液2次，灌胃體積為0.4mL/10g。對(duì)照組每只小鼠給以生理鹽水，一天兩次，灌胃體積為0.4mL/10g。兩組小鼠給藥后連續(xù)觀察14天。期間若有死亡小鼠即刻尸解，肉眼觀察小鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎等)的變化，若肉眼可見(jiàn)異常則進(jìn)行病理檢查。若無(wú)14天后處死全部存活小鼠，解剖和尸檢內(nèi)臟器官有無(wú)異常。并記錄14天內(nèi)雌雄小鼠的行為活動(dòng)、被毛、皮膚、呼吸、大小便、食欲，鼻、眼、口腔有無(wú)異常分泌物等情況(見(jiàn)附錄Ⅰ)。根據(jù)公式計(jì)算出其能達(dá)到人用量的多少倍[9~11]，計(jì)算公式如下：每只的小鼠耐受藥量成人平均體重(60000g)小鼠的最大耐受倍數(shù)(倍)小鼠平均體重(20g)成人每日用量。
2、連花解毒顆粒對(duì)角叉菜膠所致大鼠發(fā)熱的解熱作用[13-15]
2.1人與大鼠之間給藥量的換算
2.2致熱因子溶液的配制與發(fā)熱模型的建立
2.2.1致熱因子的制備：精密稱取角叉菜膠(卡拉膠)100mg置于試管中，加入滅菌生理鹽水(或蒸餾水)10mL，輕輕攪拌或搖勻，放置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日晨取出，輕輕倒置數(shù)次直至混懸液均勻。
2.2.2發(fā)熱模型的建立：取12只健康大鼠，雌雄各半，于實(shí)驗(yàn)前8～10h禁食，但不禁水。實(shí)驗(yàn)前三天，每日測(cè)大鼠肛溫2次，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日每小時(shí)測(cè)肛溫1次，連續(xù)3次，選取體溫變化不高于0.3℃的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取被選中的大鼠肛溫平均值為基礎(chǔ)體溫。于大鼠兩爪腳跖皮下各注射1%角叉菜膠懸液0.1mL/爪，分別于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h測(cè)大鼠肛溫，觀察大鼠建模情況，如注射致熱因子4小時(shí)后，大鼠體溫開(kāi)始升高，至6~7小時(shí)達(dá)高峰，并持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于10小時(shí)，則可判斷為建模成功，視情況調(diào)整致熱因子的種類(lèi)和劑量。
2.3預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察：選取20只健康大鼠，雌雄各半，于實(shí)驗(yàn)前8～10h禁食，但不禁水。實(shí)驗(yàn)前三天，每日用體溫計(jì)測(cè)大鼠肛溫2次，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日每小時(shí)測(cè)肛溫1次，連續(xù)3次，選取肛溫變化不高于0.3℃的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取被選中大鼠肛溫的平均值為基礎(chǔ)體溫。以角叉菜膠作為致熱因子，參考相關(guān)文獻(xiàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置兩種實(shí)驗(yàn)方法：
①大鼠每天給濃度為0.4g/mL連花解度顆粒3mL一次，連續(xù)3d。末次給藥后，用體溫計(jì)測(cè)量致熱前肛溫，然后于大鼠兩爪腳跖皮下各注射1%角叉菜膠懸液0.1mL/爪，此后分別于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h測(cè)大鼠肛溫。
�、谟诖笫髢勺δ_跖皮下各注射1%角叉菜膠懸液0.1mL/爪，此后立即給予每只大鼠濃度為
0.4g/mL連花解度顆粒3mL，分別于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h測(cè)大鼠肛溫。觀察動(dòng)物反應(yīng)情況和體溫變化，選擇最佳的實(shí)驗(yàn)方法(給藥量計(jì)算：連花解毒顆粒60kg人每天用量為60g，按體表面積折算0.2kg大鼠正常用量為1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，即連花解毒顆粒配制的濃度為1.2g/3mL=0.4g/mL)。
2.4連花解度顆粒解熱效果正式實(shí)驗(yàn)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取實(shí)驗(yàn)方案。大鼠于實(shí)驗(yàn)前8～10h禁食，但不禁水。每日用體溫計(jì)測(cè)大鼠肛溫2次，連續(xù)3日，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日每小時(shí)測(cè)體溫1次，連續(xù)3次，選取體溫變化不高于0.3℃的健康大鼠，取被選中大鼠體溫的平均值為基礎(chǔ)體溫。將大鼠隨機(jī)分成七組，灌服以下七種藥物：
�、龠B花解毒顆粒低劑量組：0.2g/mL連花解度顆粒3mL
�、谶B花解毒顆粒中劑量組：0.4g/mL連花解度顆粒3mL
�、圻B花解毒顆粒高劑量組：0.8g/mL連花解度顆粒3mL
④雙黃連顆粒陽(yáng)性對(duì)照品組：0.2g/mL柴黃顆粒3mL
�、莅⑺酒チ株�(yáng)性對(duì)照品組：6.7mg/mL阿司匹林3mL
�、蘅瞻纵o料對(duì)照組：266.7mg/mL空白輔料3mL
�、吣Ｐ徒M：不給藥根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的試驗(yàn)方法建模，于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h測(cè)大鼠肛溫。記錄每只大鼠的體溫變化并繪制曲線圖，利用SPSS軟件分析計(jì)算，判斷連花解毒顆粒組與模型組體溫差別是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即連花解毒顆粒的解熱效果(給藥量計(jì)算：①連花解毒顆粒60kg人每天用量為60g，按體表面積折算0.2kg大鼠正常用量為1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，因此配制的連花解毒顆粒中劑量組濃度為1.2g/3mL=0.4g/mL;②雙黃連顆粒60kg人每天用量為30g，則大鼠正常用量為0.6g，因此配制的雙黃連顆粒的濃度0.6g/3mL=0.2g/mL;③通過(guò)查閱文獻(xiàn)，解熱實(shí)驗(yàn)大鼠阿司匹林對(duì)照組用量為20mg/d，因此配制阿司匹林濃度為20mg/3mL=6.7mg/mL;④連花解毒顆粒人每天用量為40g，0.2kg大鼠正常用量為0.8g，0.2kg大鼠每次可灌胃3mL，0.8g/3mL=266.7mg/mL)。
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