瘦素對(duì)大鼠血管平滑肌舒縮功能的影響及其機(jī)制
【關(guān)鍵詞】 主動(dòng)脈【Abstract】 AIM: To investigate the effects of leptin on the contraction and relaxation of isolated thoracic aortic smooth muscle and its mechanism. METHODS: Isolated thoracic aorta was perfused and the tension of the vessel was measured. The activity of Na+K+ATPase of vascular smooth muscle cells (VSMC) was measured by biochemical method. RESULTS: ① Leptin promoted the vasoconstriction induced by noradrenaline and prolonged the relaxation duration of isolated thoracic aorta. ② Leptin inhibited the activity of Na+K+ATPase. ③ Wortmannin inhibited the above effects of leptin on VSMC. CONCLUSION: ① The effect of leptin on contraction and relaxation of isolated vascular smooth muscle may be related to the intracellular change of the activity of Na+K+ATPase. ② Leptin affects the activity of Na+K+ATPase by intracellular PI3K signal pathway.
【Keywords】 leptin; aorta, thoracic; Na+K+exchanging ATPase; PI3K; calcium
【摘要】 目的： 觀察瘦素對(duì)離體血管平滑肌收縮和舒張功能的影響，并探討其機(jī)制. 方法： 采用離體血管灌流試驗(yàn)，測(cè)定血管平滑肌的張力改變；貼塊法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell, VSMC），生化定磷法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Na+K+ATPase活性的改變. 結(jié)果： ① 瘦素對(duì)去甲腎上腺素（noradrenaline, NE）引起的血管平滑肌收縮有明顯促進(jìn)作用，且明顯延長(zhǎng)其舒張時(shí)間；② 瘦素抑制VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性且有劑量和時(shí)間依賴性；③ PI3K抑制劑Wortmannin可抑制瘦素對(duì)VSMC的上述作用. 結(jié)論： ① 瘦素對(duì)血管平滑肌舒縮功能的影響與其抑制VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性，使細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高有關(guān)；② 瘦素對(duì)Na+K+ATPase活性的影響是經(jīng)由受體后PI3K信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的.
【關(guān)鍵詞】 瘦素；主動(dòng)脈，胸；Na+K+交換ATP酶；PI3K；鈣
0引言
瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的由167個(gè)氨基酸組成的多肽,不僅調(diào)控?cái)z食和能量代謝，還參與代謝紊亂綜合征和心血管疾病的發(fā)病. 研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者的血壓與血漿瘦素濃度相關(guān)，表明瘦素在肥胖相關(guān)性高血壓的發(fā)病中起重要作用. 目前認(rèn)為，高瘦素血癥可通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎交感神經(jīng)活性升高血壓，并且還可通過影響組織細(xì)胞的離子代謝參與高血壓的發(fā)病. Jerzy等［1］的研究認(rèn)為，瘦素可降低正常大鼠腎髓質(zhì)Na+K+ATPase活性. 在3T3L1纖維原細(xì)胞，瘦素也能抑制其Na+K+ATPase活性并且和作用濃度、作用時(shí)間有關(guān)［2］. Oda等［3］的研究證實(shí)，VSMC上不僅存在瘦素受體短型，瘦素還可促使VSMC的增殖和遷移. VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性降低可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高，Na+/Ca2+交換增強(qiáng)而使細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i增加. 從而抑制平滑肌的舒張. 因此， 研究瘦素對(duì)VSMC內(nèi)Na+K+ATPase的作用有助于揭示肥胖相關(guān)性高血壓的發(fā)病機(jī)制.
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠40只，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量170~180 g，雌雄不拘，隨機(jī)分為對(duì)照組和瘦素處理組（n=20）. 鼠瘦素為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品，渥曼青霉素（Wortmannin）為美國(guó)Alexis公司產(chǎn)品，ATPase檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn). XWT104型自動(dòng)平衡記錄儀由上海大華儀表廠制造，721分光光度計(jì)由上海第三分析儀器廠制造.
1.2方法
1.2.1大鼠離體胸主動(dòng)脈平滑肌環(huán)的制備大鼠頸椎脫位處死后，迅速取胸主動(dòng)脈. 置于pH 7.4改良臺(tái)式液［成分(g/L)： NaCl 8.7, KCl 0.2, MgCl2 0.4, CaCl2 0.4, 葡萄糖1.0,三羥甲基氨基甲烷鹽酸0.07］中，制備成3 mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)，機(jī)械摩擦的方法去除內(nèi)皮. 用銀絲將血管環(huán)懸掛于37℃的恒溫浴槽中，pH 7.4改良臺(tái)式液灌流，溶液中通以950 mL/L O2. 用張力換能器將血管環(huán)的張力變化記錄于記錄儀上，基礎(chǔ)張力定為9.8×10-3 N. 血管環(huán)平衡90 min后開始實(shí)驗(yàn).
1.2.2離體血管舒縮能力的測(cè)定① 血管收縮張力的測(cè)定： 血管環(huán)平衡后，以終濃度為1 μmol/L的NE誘發(fā)其收縮反應(yīng)，記錄1, 2, 4, 6, 8, 10 min的張力和最大收縮張力. 對(duì)照組： 血管環(huán)不用瘦素處理；瘦素處理組： 血管環(huán)與1 μmol/L瘦素溶液共同溫育30 min后，重復(fù)與對(duì)照組相同的步驟；② 血管舒張速度的測(cè)定： 血管環(huán)平衡后，以1 μmol/L的NE收縮至其最大收縮張力，改良臺(tái)式液洗脫NE，記錄1~12 min的血管張力對(duì)最大收縮張力的百分比，分組與處理同上.
1.2.3VSMC的培養(yǎng)按文獻(xiàn)［4］方法培養(yǎng)VSMC. 取體質(zhì)量在90~110 g的SD大鼠5只，處死后無菌條件下取胸腹主動(dòng)脈. 貼塊法行原代VSMC培養(yǎng). DMEM培養(yǎng)基內(nèi)含200 g/L胎牛血清，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度37℃，充以50 mL/L的CO2，每周換液2~3次，細(xì)胞間完全融合后傳代. 實(shí)驗(yàn)采用第4~6代細(xì)胞.
1.2.4VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞傳代至所需數(shù)量后，把所有培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至一瓶后計(jì)數(shù)，調(diào)整懸浮細(xì)胞的密度為1×109/L，按每管加入1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管，分為4組： ① 對(duì)照組（n=5），不加入任何藥物；② 不同濃度瘦素處理組，分4個(gè)亞組（n=5），分別用終濃度為0.9, 9, 90, 900 nmol/L的瘦素和細(xì)胞共同溫育15 min；③ Wortmannin+瘦素處理組，以終濃度為100 nmol/L的Wortmannin與細(xì)胞共同溫育20 min后，再分別用不同濃度的瘦素處理細(xì)胞15 min，瘦素濃度分組同②；④ 瘦素處理不同時(shí)間組，分5個(gè)亞組（n=5），用終濃度為100 nmol/L的瘦素分別與VSMC共同溫育0, 5, 15, 30, 60 min，以0 min作為對(duì)照組. 上述干預(yù)前，細(xì)胞均在不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)饑餓2 h.
1.2.5VSMC內(nèi)Na+K+ATPase的活性測(cè)定上述分組后的細(xì)胞懸液以2000 r/min離心10 min，棄上清液，留沉淀細(xì)胞，加5 mL生理鹽水混勻，重新以2000 r/min離心10 min，棄上清液，將沉淀細(xì)胞加三蒸水至1 mL. 在漩渦混勻器上混勻30 s，放置15 min使其充分破碎. 取樣200 μL按試劑盒操作說明書進(jìn)行，721分光光度計(jì)660 nm處調(diào)零比色. 每一樣本Na+K+ATPase活性均測(cè)平行管，求其平均值. 規(guī)定每小時(shí)每1×105個(gè)細(xì)胞的ATPase分解ATP產(chǎn)生1 μmol/L無機(jī)磷的量為一個(gè)ATPase活力單位.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析與完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析. P<0.05有顯著性差異.
2結(jié)果
2.1瘦素對(duì)血管收縮和舒張功能的影響① 血管收縮張力的比較： 瘦素處理前后血管收縮張力有顯著性差異（P<0.01, Fig 1）. 收縮張力在瘦素處理前后隨時(shí)間變化的趨勢(shì)不同（P<0.01），測(cè)量時(shí)間與處理因素存在交互作用（P<0.01）. 血管于10 min達(dá)到最大收縮張力，瘦素處理前后的最大收縮張力均值分別為（7.84±0.78）×10-3 N （0.80±0.08 g）和（8.31±0.88）×10-3 N（0.95±0.09 g）;② 血管舒張速度的比較： 瘦素處理前后血管舒張速度有顯著性差異（P<0.01, Fig 2）. 瘦素處理前后舒張速度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)不同（P<0.01），測(cè)量時(shí)間與處理因素存在交互作用（P<0.01）.
2.2VSMC的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定血管組織貼壁生長(zhǎng)5~6 d后，可見VSMC從組織塊邊緣遷出. 細(xì)胞多層重疊貼壁生長(zhǎng)呈高低起伏的“峰-谷”狀，細(xì)胞呈梭形（Fig 3, 4）. 鼠抗人αactin免疫染色鑒定細(xì)胞純度達(dá)到95%以上.2.3不同濃度瘦素對(duì)VSMC的Na+K+ATPase活性的影響及Wortmannin的阻斷作用0.9 nmol/L leptin組與對(duì)照組間的Na+K+ATPase活性已有顯著性差異（P<0.05），且其活性抑制程度與瘦素濃度正相關(guān)（r=0.877, P<0.01）. 與對(duì)照組相比，Wortmannin+瘦素組在9, 90, 900 nmol/L瘦素濃度時(shí)Na+K+ATPase活性有顯著性降低（Fig 5）. 在9, 90, 900 nmol/L瘦素濃度時(shí)，瘦素組較Wortmannin+瘦素組Na+K+ATPase活性均有顯著性降低.
2.4瘦素處理不同時(shí)間對(duì)VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性的影響與對(duì)照組比較，瘦素處理5 min后，Na+K+ATPase活性即顯著下降，為對(duì)照組的93.9%（P<0.05），隨瘦素處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Na+K+ATPase活性抑制有時(shí)間依賴性. 至60 min時(shí)，Na+K+ATPase活性為對(duì)照組的57.1% （Fig 6）.
3討論
通常認(rèn)為，阻力血管VSMC內(nèi)［Ca2+］i是決定血管平滑肌張力的一個(gè)重要因素,在原發(fā)性高血壓的發(fā)生初期起關(guān)鍵性作用. 胰島素可通過改變VSMC膜Na+K+ATPase的活性，影響Na+K+ATPase的基因表達(dá)來改變血管張力［5，6］. 但對(duì)作為瘦素胰島素軸中的瘦素，目前主要研究其對(duì)VSMC的增殖作用，而瘦素對(duì)VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性影響的報(bào)道很少.
研究認(rèn)為，瘦素受體短型分布于全身各組織. 國(guó)內(nèi)有人［7］發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠VSMC上有OBRb（瘦素受體長(zhǎng)型）的表達(dá)，Oda等［3］的研究認(rèn)為大鼠VSMC有瘦素受體短型的表達(dá)，為該實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù). Jerzy等［1］證實(shí)了瘦素對(duì)多種組織細(xì)胞Na+K+ATPase活性的影響. 因此，我們假設(shè)瘦素可抑制VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性，參與高血壓的發(fā)病. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瘦素處理后血管收縮張力隨時(shí)間變化的趨勢(shì)增大，血管環(huán)舒張速度顯著減慢，VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性受到抑制且表現(xiàn)為劑量和時(shí)間依賴性. 表明瘦素可直接抑制VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性，Na+Ca2+交換活性增強(qiáng)，使胞內(nèi)處于高［Ca2+］i狀態(tài)，從而使血管收縮張力增大，舒張速度減慢.
目前已知瘦素受體后的信號(hào)通路包括JAK/STAT, MAPK/ERK, PI3K通路. 在3T3L1纖維原細(xì)胞，瘦素部分通過受體后PI3K信號(hào)通路抑制Na+K+ATPase活性. 而PI3K同樣參與VSMC的Na+K+ATPase活性調(diào)控［8］. 實(shí)驗(yàn)中我們觀察到用100 nmol/L的Wortmannin（PI3K抑制劑）預(yù)處理細(xì)胞20 min后，Wortmannin+瘦素組較瘦素組VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性有顯著性升高（P<0.01）. 說明Wortmannin可通過抑制瘦素受體后PI3K信號(hào)通路干預(yù)瘦素的作用，從而影響VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性，但在瘦素濃度較高時(shí)，Wortmannin的阻斷作用有限. Wortmannin并未能完全使Na+K+ATPase活性恢復(fù)正常，說明除PI3K信號(hào)通路，可能還有其他受體后通路影響Na+K+ATPase活性.
據(jù)此，我們認(rèn)為，肥胖所致的高瘦素血癥不僅可通過增加交感神經(jīng)活性促使血管平滑肌收縮，還可通過直接抑制VSMC內(nèi)Na+K+ATPase活性，引起血管張力的改變，參與高血壓的發(fā)生.
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