淺談木犀草素對對乙酰氨基酚誘導的L02肝細胞損傷的保護作用
木犀草素，多以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高。具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。據(jù)最新研究，呼吸道癥狀咳嗽、咳痰、喘息，均與氣道慢性炎癥有關(guān)。如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、變應性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被認為與局部的炎癥浸潤有關(guān)，炎癥的存在，使得氣道的免疫應答混亂，患者常出現(xiàn)氣道反應性增高。
[摘要] 探討木犀草素(luteolin，Lut)對對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導的L02肝細胞損傷的保護作用。CCK8法檢測Lut對L02細胞活性的影響;篩選APAP誘導L02細胞損傷的濃度及作用時間;細胞形態(tài)學、CCK8實驗和流式細胞術(shù)檢測分析Lut對APAP誘導的L02細胞凋亡的影響;比色法檢測細胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl2，caspase3的表達。結(jié)果顯示Lut在2.5～40 μmol・L-1不影響L02細胞活性;12 mmol・L-1 APAP作用于L02細胞12 h可用于建立肝細胞損傷模型。與模型組相比，Lut組細胞狀態(tài)明顯改善，胞體增大，貼壁能力恢復明顯;細胞凋亡率明顯下降;MDA含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，GSH和SOD活性顯著提高(P<0.05或P<0.01)，同時能夠上調(diào)Bcl2及下調(diào)Bax，caspase3 mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)。該實驗證明了Lut對APAP誘導的L02細胞損傷有保護作用，其機制可能與其減輕氧化應激反應和抑制細胞凋亡有關(guān)。
[關(guān)鍵詞] 木犀草素; L02細胞; 氧化應激; 細胞凋亡; 對乙酰氨基酚
對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，APAP在治療劑量下安全，但過量使用會造成急性肝損傷[1]。APAP過量服用在許多國家已成為故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有證據(jù)證實細胞內(nèi)氧化應激是APAP引起急性肝損傷的重要生物學機制之一[47]，因此，探討能夠有效預防或緩解APAP引起的急性肝損傷途徑具有積極的臨床意義。
木犀草素(luteolin，Lut)屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金銀花、紫蘇葉等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[811]。本文通過預防性給藥，研究給藥后氧化應激損傷相關(guān)生理指標變化，探討Lut的細胞保護和抗凋亡作用，為對乙酰氨基酚肝損傷的防治提供進一步的實驗依據(jù)。
一、材料
1.1 細胞 正常人肝細胞株(L02)為本實驗室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2且飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。
1.2 藥品與試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)購自東仁化學科技(上海)有限公司;木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;APAP購自中國食品藥品檢定研究院;AnnexinVFITC/PI試劑盒購自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應試劑盒購自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均購自Invitrogen公司。
1.3 儀器 酶標儀( BioTek Synergy H1 H1MFD，美國);DMIL HC型倒置相差顯微鏡(Leica，德國);流式細胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)。
二、方法
2.1 細胞培養(yǎng) L02細胞培養(yǎng)按照常規(guī)培養(yǎng)的方法，含10%胎牛血清、100 kU・L-1青霉素和100 g・L-1鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.2 CCK8檢測Lut對L02細胞活性的影響 將L02細胞以7×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，接種12 h細胞全部貼壁后，分別給予0，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1的Lut，實驗設(shè)陰性對照孔和空白對照孔，每個濃度設(shè)3個復孔。在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。細胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，式中Ac為對照孔吸光度，As為實驗孔吸光度，Ab為空白孔吸光度。
2.3 APAP誘導L02細胞肝損傷模型的建立 將濃度為7×104個/mL的L02細胞接種到96孔板，每孔100 μL，接種12 h細胞全部貼壁后，設(shè)0，6，12，18，24，30 mmol・L-1濃度梯度的.APAP進行造模，實驗設(shè)陰性對照孔和空白對照孔，每個濃度設(shè)3個復孔，分別在造模3，6，12，24，48 h后棄上清液，用CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。
2.4 Lut對APAP誘導L02細胞損傷的影響 實驗分6組，分別是對照組、模型組(APAP，12 mmol・L-1)、3個實驗組(Lut，濃度分別為2.5，5，10 μmol・L-1)和陽性對照組(五味子乙素[12]，Sch B，5 μmol・L-1)。取對數(shù)生長期L02細胞，調(diào)整細胞數(shù)為7×104個/mL，接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，實驗組和陽性對照組更換為相應的含藥培養(yǎng)液，對照組和模型組更換新的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，除對照組外，其余各組加入APAP 12 mmol・L-1造模，造模12 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)后棄上清液，用CCK8檢測L02細胞的存活率。實驗重復3遍。
2.5 AnnexinV FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡 將L02細胞按照1×105個/mL 接種到6孔板中，每孔2 mL，分組、給藥及造模同2.4項，造模12 h后，將L02細胞消化下來，按照Annexin VFITC/PI說明書方法對細胞進行染色，利用流式細胞儀檢測L02細胞凋亡情況。
2.6 培養(yǎng)液MDA，GSH及SOD水平的檢測 將L02細胞按照1×105個/mL 接種到6孔板中，分組、給藥及造模同2.4項，造模12 h后收集細胞培養(yǎng)上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測細胞培養(yǎng)上清中MDA含量、GSH及SOD活性。
2.7 RTPCR檢測Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表達 分組、加藥及造模同2.2項。每組設(shè)3個復孔。造模12 h后收集細胞，應用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以βactin為內(nèi)參進行擴增，檢測細胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表達量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列見表1。實驗操作按試劑盒說明書進行。
2.8 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0應用軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
三、結(jié)果
3.1 CCK8檢測Lut對L02細胞活性的影響 為了尋找合適的Lut反應濃度，本實驗考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1) 對L02細胞活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)Lut濃度在2.5，5，10 μmol・L-1時活性最強，故本實驗采用2.5，5，10 μmol・L-1的濃度梯度進行后續(xù)試驗，見圖1。
3.2 APAP誘導L02細胞損傷模型的建立 本研究首先考察APAP濃度和刺激時間對L02細胞損傷的影響，結(jié)果顯示隨著APAP濃度的增加，L02細胞的存活率逐漸降低;隨著造模時間的延長，相同APAP濃度下的L02細胞的存活率逐漸降低。綜合考慮造模時間和造模濃度，以IC50為原則，實驗中12 mmol・L-1APAP造模12 h的抑制率為(49.64±3.30)%，因此，本研究選擇造模時間為12 h和造模濃度為12 mmol・L-1的APAP進行后續(xù)試驗，見圖2。
3.3 Lut對APAP誘導L02細胞損傷的影響 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞生長良好、背景清晰，細胞貼壁牢固，單個細胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均勻;模型組(APAP，12 mmol・L-1)細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形。與模型組相比，Lut組和陽性藥五味子乙素(Sch B)中的細胞狀態(tài)明顯改善，貼壁能力恢復明顯，胞體增大，多數(shù)細胞呈梭形。從L02細胞形態(tài)變化上可見，Lut 在一定程度上可顯著減輕APAP的損傷作用，提高細胞存活率，表明Lut對APAP損傷的L02細胞具有一定的保護作用，見圖3。
CCK8檢測結(jié)果顯示，模型組中細胞存活率顯著降低(P<0.01)，約為對照組的50%，Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)和Sch B組細胞活力較模型組均有升高的趨勢(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯，表明Lut對于APAP誘導的細胞損傷具有保護作用，這與細胞形態(tài)學結(jié)果一致，見圖3。
3.4 Lut 對L02細胞凋亡的影響 凋亡流式檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組(APAP，12 mmol・L-1)細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組相比，Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)凋亡率顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1Lut組效果最為明顯，見圖4。結(jié)果表明，Lut可顯著抑制APAP誘導的L02細胞凋亡。細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。
3.5 木犀草素對APAP誘導的L02細胞中MDA，GSH及SOD的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，APAP組MDA含量明顯升高，而GSH和SOD活性明顯降低(P<0.05或P<0.01);與模型組相比，不同濃度的Lut及Sch B可明顯降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，同時明顯提高GSH和SOD活性(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯，見表2。
3.6 Lut對凋亡相關(guān)基因Bcl2，Bax和caspase3表達的影響 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，APAP組Bax和caspase3 mRNA表達明顯升高(P<0.01)，同時Bcl2 mRNA表達明顯降低(P<0.01);與模型組相比，Lut組Bax和caspase3 mRNA表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)，同時Bcl2 mRNA表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1Lut組效果最為明顯，提示Lut具有明顯的抑制L02細胞凋亡的作用，見表3。
四、討論
近年研究表明Lut具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。本研究通過建立APAP誘導的肝損傷模型，探討Lut對APAP誘導的L02細胞損傷的保護作用。APAP 誘導建立的肝損傷模型是目前較為常用的肝損傷模型，此模型造模時間短、易復制、穩(wěn)定性好，是篩選保肝藥物的理想模型[1315]。本實驗發(fā)現(xiàn)，APAP(12 mmol・L-1)能明顯抑制L02細胞活性，Lut干預后，與模型組比較，L02細胞活性明顯改善，其中10 μmol・L-1 Lut的藥效最為明顯。
氧化應激在APAP誘導的肝損傷中起著重要作用[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，其高低常常可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是平衡機體氧化與抗氧化的關(guān)鍵酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。SOD活性也是判斷細胞損傷程度的相關(guān)指標。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的超氧離子及其他自由基，防止肝細胞損傷。GSH 是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，其水平的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。因而本實驗測定三者水平來反映細胞氧化應激水平。本研究顯示，與模型組相比，Lut組氧化指標MDA含量明顯降低，抗氧化指標GSH和SOD活性則顯著提高(P<0.05或P<0.01)，研究初步表明木犀草素可通過減輕氧化應激反應而達到抑制APAP誘導的肝損傷。
氧化應激損傷可以引起細胞凋亡，本實驗中細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形;而Lut組細胞狀態(tài)較模型組明顯改善，貼壁能力恢復明顯，胞體增大。CCK8檢測結(jié)果顯示，模型組中細胞存活率顯著降低(P<0.01)，而Lut組(2.5，5，10 μmol・L-1)的細胞活力較模型組均有升高的趨勢(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1 Lut組效果最為明顯。凋亡流式結(jié)果表明，APAP可明顯誘導L02細胞凋亡，Lut預給藥后的各組細胞凋亡數(shù)量與模型組相比明顯減少(P<0.05或P<0.01)，以上結(jié)果表明Lut能夠抑制APAP誘導的細胞凋亡。
細胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序性死亡的過程，現(xiàn)已知多種基因與細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導相關(guān)，包括Bcl2家族基因(Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等)，p53，F(xiàn)as，F(xiàn)asL等都參與了凋亡的調(diào)控[17]。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促進凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制細胞凋亡[18]，Bax則通過抑制Bcl2的活性誘導細胞凋亡[19]。caspase3屬于半胱氨酸蛋白酶家族一員，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase3表達的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑凋亡信號通路共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)生的標志酶[20]。RTPCR結(jié)果顯示，木犀草素是通過下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及促進Bcl2 mRNA的表達而抑制APAP誘導的細胞凋亡。
綜上所述，木犀草素通過抑制氧化應激和細胞凋亡實現(xiàn)其對APAP誘導的L02細胞損傷的保護作用。其機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化，增強GSH和SOD活性，同時下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及上調(diào)Bcl2 mRNA的表達有關(guān)，但詳細機制還有待進一步探討。
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