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種新型的基因開關(guān)RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)
畢業(yè)論文1
種新型的基因開關(guān)—RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)
小星 尤圣武 彭章龍 于布為
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院麻醉科
隨著基因治療研究的不斷深入,目的基因的精確表達(dá)已經(jīng)成為首要問題.由
于解決上述問題最好的方法就是擁有1系列復(fù)雜嚴(yán)密的基因調(diào)控系統(tǒng),所以研究
者們1直在尋求1種高效可靠的誘導(dǎo)調(diào)控體系,而RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)就是目
前找到的較好的1種.近10年來這1系統(tǒng)的研究已很廣泛,它的結(jié)構(gòu)也有幾次大
的改進(jìn),現(xiàn)就此予以綜述.
RU486調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
1 RU486調(diào)控系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)
RU486調(diào)控系統(tǒng)是1994年被Wang等[1]提出的,它由嵌合調(diào)控子反式作用
調(diào)控區(qū)和目的基因區(qū)兩部分組成.反式作用調(diào)控區(qū)含有任意啟動子控制下的嵌合
調(diào)控子(chimeric regulator, GLVP),后者是1種嵌合型的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子,它包
括酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4的DNA結(jié)合區(qū)(Gal4DBD),單純皰疹病毒蛋白VP16激
活區(qū)(VP16AD)和PR-891突變體改良后的C末端配體結(jié)合區(qū)(PRLBD-891)
3部分.目的基因區(qū)是指在最小啟動子(TATA盒或胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動
子tk)和4個Gal4 DNA結(jié)合區(qū)串聯(lián)體(p17×4)調(diào)控下的目的基因,如圖1.
圖1 RU486調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖
在GLVP中,Gal4DBD 代替了孕酮受體的DNA結(jié)合區(qū),從而避免了任何
激活內(nèi)源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4 DBD在哺乳動物細(xì)胞中不
中華麻醉在線 http://www.csaol.cn 2007年9月
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存在,目前也沒有發(fā)現(xiàn)任何哺乳動物的靶基因可以被Gal4激活,所以這1調(diào)控
子只會調(diào)控目的基因的表達(dá),而不會影響任何內(nèi)源基因[1].PR-891是指野生型孕
酮受體在891位點(diǎn)平頭切斷造成的突變體,因此其不能與孕酮受體激活劑R5020
結(jié)合,但卻可以與抗孕酮片RU486結(jié)合,從而在RU486存在時激活孕酮受體介
導(dǎo)的基因.這可能是由于PR-891比野生型受體少42個氨基酸,而孕酮結(jié)合位點(diǎn)
屬于缺失的下游內(nèi),RU486結(jié)合區(qū)則位于上游位置[2].這就避免了給予RU486
時,激活內(nèi)源性孕酮受體誘導(dǎo)其它基因引起1系列的細(xì)胞反應(yīng).并且由于反式作
用調(diào)控子是1種嵌合型的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子,所以它不再與孕酮反應(yīng)元件(PREs)
或糖皮質(zhì)類固醇應(yīng)答成分(GREs)結(jié)合[3],干預(yù)孕酮受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,取而代
之的是在RU486作用下,這1調(diào)控子僅僅與目的基因區(qū)的Gal4DBD結(jié)合,并激
活目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[2].由于PRLBD-891的轉(zhuǎn)活能力較差,而VP16AD,即VP16
的 C末端為酸性,可以直接與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的轉(zhuǎn)錄因子TFIIB,TATA結(jié)合
蛋白(TBP)和TBP輔助因子TAFII40相互作用,具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)活功能.
在目的基因區(qū)內(nèi),啟動子有兩種:胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子(tk)和腺
病毒E1b基因中僅僅包含TATA盒的最小啟動子.Tsai[2]等使用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移
酶(CAT)作報告基因?qū)?者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT
轉(zhuǎn)染時CAT基礎(chǔ)活力明顯要低1些;而給予RU486后,前者的CAT效能可達(dá)
大約50倍,后者僅有10~15倍.這可能是由于tk啟動子中含有GC和CAAT盒
等序列,從而使轉(zhuǎn)錄效能較大.所以TATA盒啟動子結(jié)構(gòu)應(yīng)用于要求目的基因的
基礎(chǔ)表達(dá)很低時,而在基礎(chǔ)活力稍高能夠耐受,要求轉(zhuǎn)錄效能很大時應(yīng)使用tk
啟動子結(jié)構(gòu).對于p17x4,Gal4 DNA結(jié)合區(qū)的4個串聯(lián)體則在這1系統(tǒng)中可以
提供最大的轉(zhuǎn)錄效能.
2 RU486調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)改進(jìn)
為了使RU486調(diào)控系統(tǒng)將來能夠應(yīng)用于人類的基因治療,降低細(xì)胞毒性和
免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成員――人的p65激活區(qū)(286~550)
替代VP16激活區(qū),構(gòu)建出新的RU486反式作用調(diào)控區(qū)(GLP65),以減少VP16
激活區(qū)可能帶來的免疫反應(yīng).他們發(fā)現(xiàn)使用TATA盒啟動子啟動目的基因時,在
沒有RU486的情況下,GLP65的基礎(chǔ)活力明顯低于GLVP;給予RU486后兩個
調(diào)控子均表現(xiàn)出配體劑量依賴性的目的基因表達(dá),這時GLVP組目的基因的表達(dá)
3
更多,不過由于GLP65的基礎(chǔ)值很低,所以RU486給予時,目的基因的表達(dá)倍
數(shù)會更高.tk做目的基因啟動子時,上述兩種RU486系統(tǒng)則不管是否給予配體,
兩者的作用相當(dāng).所以在使用GLP65時,最好選用TATA盒啟動子作為目的基
因的啟動子.
另外,Mark等[4]在反式調(diào)控區(qū)與目的基因區(qū)之間插入小雞β-球蛋白5'端區(qū)
域作為絕緣子(INS)將2者分隔,使目的基因在沒有RU486的情況下不受調(diào)控
系統(tǒng)的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生表達(dá).但是他們發(fā)現(xiàn)在活體大鼠模型,沒有RU486表達(dá),有
無絕緣子都不會有目的基因的表達(dá);但是HELA細(xì)胞水平上,不含絕緣子者的
目的基因則會有較少的表達(dá),而含絕緣子者沒有.
2 RU486調(diào)控系統(tǒng)的激活
RU486調(diào)控系統(tǒng)的激活過程與甾體類激素被其配體激活相似.反式作用調(diào)
控子可以在不同的組織定向啟動子作用下,在各自靶向的組織或細(xì)胞進(jìn)行表達(dá).
當(dāng)存在RU486時, RU486與PRLBD-891相結(jié)合,促使反式作用調(diào)控子發(fā)生構(gòu)
象變化形成2聚體而激活,激活的反式作用調(diào)控子與目的基因上游的Gal4 DNA
結(jié)合區(qū)4聚體結(jié)合,從而啟動目的基因的表達(dá),如圖2.反之,在沒有RU486
的情況下,由于反式作用調(diào)控子的構(gòu)象不會發(fā)生變化,所以RU486調(diào)控系統(tǒng)不
能被激活,即目的基因不能轉(zhuǎn)錄表達(dá).這樣,RU486調(diào)控系統(tǒng)便可根據(jù)RU486
的量及給予時間,對目的基因的表達(dá)水平及其表達(dá)時程的長短進(jìn)行控制[2].
圖2 RU486調(diào)控系統(tǒng)激活示意圖
3 RU486調(diào)控系統(tǒng)的特點(diǎn)
1. 調(diào)控子的激活依賴于RU486的給予.在沒有RU486的情況下,調(diào)控子所表
4
達(dá)的蛋白沒有毒性,也不傳遞表型,調(diào)控子不能激活目的基因的表達(dá).只有
給予RU486激活調(diào)控子后,目的基因才會表達(dá)蛋白.
2. RU486調(diào)控系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因的表達(dá),所以可以直接控制后者的
表達(dá).
3. RU486給予量很小,僅僅能夠激活調(diào)控子,并不能抑制內(nèi)源性孕酮受體或糖
皮質(zhì)激素受體的功能.眾所周知,RU486作為孕酮和糖皮質(zhì)激素的拮抗劑時,
它的濃度范圍須達(dá)微克分子級,所以在臨床使用中RU486作為流產(chǎn)藥物的
劑量應(yīng)達(dá)600mg或10mg/kg.然而,在RU486調(diào)控系統(tǒng)中的RU486只需很
少的濃度就可使目的基因表達(dá).Wang等曾做RU486的濃度對照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),
當(dāng)RU486濃度僅有0.1nmol/l時即可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),并且系統(tǒng)達(dá)到最
大活力時的濃度也僅須1nmol/l,這1劑量要比產(chǎn)生內(nèi)源拮抗作用的濃度低
1000倍[1].
4. 調(diào)控過程是可逆的,且其使目的基因大量表達(dá).RU486停藥后目的基因表達(dá)
停止,RU486的重復(fù)給予也會重復(fù)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá).
5. RU486調(diào)控系統(tǒng)非常適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療.因?yàn)榉肦U486后,
其很容易通過血腦屏障,在臨床中可以安全使用.
4 RU486調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用
1 RU486調(diào)控系統(tǒng)在單純皰疹病毒載體(HSV)中的調(diào)控
Oligino[5]等將RU486系統(tǒng)引入無復(fù)制能力HSV載體中,lacZ為目的基因的
目的基因區(qū)(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶位點(diǎn),反式
作用調(diào)控區(qū)(VP-GL)置入同1載體的糖蛋白C位點(diǎn),構(gòu)建成HSV重組病毒
GVHLZ.在病毒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞24h后,他們發(fā)現(xiàn)如果不給RU486,lacZ表達(dá)很
低;若將細(xì)胞培養(yǎng)在含10-7mol/L的RU486基質(zhì)中時,lacZ就會大量表達(dá).并且,
10-7mol/L的RU486即可使目的基因表達(dá)達(dá)最大.將GVHLZ注入SD大鼠海馬
后12和36h,給予RU486或生理鹽水作對照,48h后處死大鼠取出海馬進(jìn)行檢
測,Oligino發(fā)現(xiàn)lacZ表達(dá)比對照組高達(dá)150倍.
2 RU486調(diào)控系統(tǒng)在腺病毒載體(Ad)中的調(diào)控
Magnus等[6]首次將RU486系統(tǒng)引入重組腺病毒載體中,CAT作為報告基因
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與p17x5-TATA結(jié)合插入Ad中形成AdG5TripCAT,反式作用調(diào)控區(qū)插入Ad形
成Ad5dl309,將兩者共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞.他們在轉(zhuǎn)染開始給予RU486后16h用
ELISA法檢測CAT的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CAT的表達(dá)隨RU486給予量增加而逐漸增大,
當(dāng)RU486達(dá)4umol/l時CAT達(dá)最大.
2004年,錢程[7]等成功構(gòu)建出RU486調(diào)控并攜帶IL12的第3代腺病毒,并
將其進(jìn)行了體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)RU486可以誘導(dǎo)和調(diào)控IL12的表達(dá),
這種誘導(dǎo)呈劑量依賴性變化,并且在調(diào)整RU486的給藥間隔和重復(fù)給藥,IL12
的表達(dá)也會隨其波動變化或維持在1定水平,RU486調(diào)控系統(tǒng)的基因開關(guān)作用
表現(xiàn)完全.最近,Schillinger[8]等也將RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)引入到高血壓的基因
治療,將RU486調(diào)控系統(tǒng)控制的心房利尿肽(ANP)插入到第3代腺病毒載體
中,從而實(shí)現(xiàn)了對ANP表達(dá)的劑量和時程控制.并且第3代腺病毒的超大容量,
低免疫源性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)使得這1系統(tǒng)更加完美.
3 RU486調(diào)控系統(tǒng)在果蠅中的調(diào)控
Gregg Roman[9]等利用RU486調(diào)控系統(tǒng)對轉(zhuǎn)入果蠅的目的基因進(jìn)行時間和空
間的調(diào)控.他們將RU486調(diào)控系統(tǒng)插入到P{Switch}放大檢測元件構(gòu)成的質(zhì)粒注
入果蠅胚胎中,待果蠅4天大時給予RU486飲食.結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過RU486基因開
關(guān)可以對目的基因進(jìn)行時序上的調(diào)控,在給予RU486飲食后1h即可得到非常高
濃度的表達(dá),3h后指示針可以檢測到目的基因的活力.并且RU486的給予不會
引起任何的不良反應(yīng),它不會增加果蠅的致死率,也不會影響果蠅的趨光性,趨
地性和逃避反應(yīng)等行為,僅有基因開關(guān)的誘導(dǎo)功能.Osterwalder[10]等則利用
RU486調(diào)控系統(tǒng)對組織特異性的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,發(fā)現(xiàn)在果蠅胚后期,RU486
調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控幼蟲神經(jīng)肌肉接頭突觸前后的轉(zhuǎn)基因表達(dá).
4 RU486調(diào)控系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因動物中的調(diào)控
2005年Bo等[11]又將RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到轉(zhuǎn)基因大鼠體內(nèi),通過控
制RU486的給予觀察轉(zhuǎn)基因大鼠心內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá).他們使用心臟特異性α肌
球蛋白重鏈(αMHC)啟動子調(diào)控GLP65系統(tǒng),將含有反式作用調(diào)控區(qū)的載體
注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65轉(zhuǎn)基因大鼠,然后同樣方法得到
含人生長激素目的基因區(qū)(17X4-tk-hGH)的轉(zhuǎn)基因大鼠,兩者雜交得到雙重轉(zhuǎn)
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基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天給大鼠腹腔內(nèi)注射RU486(500ug/kg)
觀察.結(jié)果發(fā)現(xiàn)不給予RU486,hGH的表達(dá)始終處于很低的基礎(chǔ)值;而隨著RU486
的不斷給予轉(zhuǎn)基因大鼠的hGH呈劑量依賴性表達(dá),但在停藥后7天內(nèi)轉(zhuǎn)基因表
達(dá)即可降至基礎(chǔ)水平;對于單轉(zhuǎn)基因αMHC-GLP65大鼠,給予RU486后未發(fā)現(xiàn)
任何表型出現(xiàn).并且他們還首次報道,這1調(diào)控系統(tǒng)的作用對于任何年齡的大鼠
都可適用.
5 其他的基因開關(guān)
目前基因開關(guān)的種類已經(jīng)有很多,如4環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),甾體激素,免疫抑制
劑,β-D-異丙基硫代半乳糖苷,FK1012細(xì)胞膜調(diào)控系統(tǒng)等等.雖然這些調(diào)控系
統(tǒng)各自有各自的應(yīng)用范圍和優(yōu)點(diǎn),但是其中有些可能會激活其它的內(nèi)源基因,如
FK1012細(xì)胞膜調(diào)控系統(tǒng),它是運(yùn)用1種免疫抑制劑FK506的2聚體FK1012,
通過激活細(xì)胞酪氨酸激酶途徑來調(diào)控基因表達(dá),因此由于細(xì)胞膜受體激酶級聯(lián)反
應(yīng)干預(yù)多種內(nèi)源基因的表達(dá),所以這1系統(tǒng)無法調(diào)控特異的目的基因[2].有些效
力較低,或者在動物和人轉(zhuǎn)基因運(yùn)用中毒性較大(β-D-異丙基硫代半乳糖苷).
4環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)則由于4環(huán)素在骨與其他組織的清除率較慢而引起關(guān)注.
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