三葉青的毒理學(xué)研究
關(guān)鍵字： 毒理學(xué)三葉青為葡萄科植物三葉崖爬滕Tetrastigma hems-leyanum Diels et Gilg的根 ［1］ ，又名金線(xiàn)吊葫蘆、石老鼠。在浙江民間素有食用習(xí)俗，為評(píng)價(jià)其安全性。我們按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中“食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)”進(jìn)行實(shí)驗(yàn) ［2］ ，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 樣品
三葉青塊根，切片，10倍水浸泡2h，每次1h，收集煎液。濃縮成1g生藥/ml濃度，由杭州天惠醫(yī)藥科技有限公司提供。按民間食用習(xí)慣15g/人/d計(jì)算。
2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和檢測(cè)條件
實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為2001001，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施合格證號(hào)為2001001。實(shí)驗(yàn)用SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí):醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為2001001，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施合格證號(hào)為2001001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2001。檢測(cè)環(huán)境條件:溫度范圍20℃～25℃，相對(duì)濕度范圍60%～70%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)3天，染毒前禁食過(guò)夜，不限制飲水。
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)
3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康、成熟、體重180～220g SD大鼠20只，雌雄各半。
3.1.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗(yàn)方法將大鼠分為10.0g/kg，體重劑量組，每組20只，雌雄各半。大鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀(guān)察14天，并記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。
3.1.3 觀(guān)察指標(biāo) 染毒后，觀(guān)察大鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀(guān)察期限2周。
3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)
3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康、成熟、休重18～22g ICR小鼠20只，雌雄各半。
3.2.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗(yàn)方法將小鼠分為40.0g/kg體重劑量組，每組20只，雌雄各半。小鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀(guān)察14天，并記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。
3.2.3 觀(guān)察指標(biāo) 染毒后，觀(guān)察小鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀(guān)察期限兩周。3.3 Ames試驗(yàn)
3.3.1 試驗(yàn)菌株 選用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌，共四株，即TA 97a 、TA 98 、TA 100 、TA 102 。由上海勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病研究所提供，經(jīng)生物學(xué)鑒定合格后進(jìn)行試驗(yàn)。
3.3.2 劑量選擇及陽(yáng)性對(duì)照物 試驗(yàn)采用平板摻入法。樣品以蒸餾水稀釋至相應(yīng)劑量。用TA 100 菌株的非代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果在劑量為5000μg/皿時(shí)未出現(xiàn)明顯的增菌和抑菌現(xiàn)象，故正式試驗(yàn)時(shí)選擇試驗(yàn)濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個(gè)劑量組，外加陰性對(duì)照（蒸餾水，DMSO）和陽(yáng)性對(duì)照組（9-氨基吖啶、2，7-二氨基芴、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴、絲裂霉素C、1，8-二羥基蒽醌），每種菌株每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)三皿平行，在加和不加S 9 條件下進(jìn)行試驗(yàn)。 3.3.3 觀(guān)察指標(biāo) 直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回菌落數(shù)。
3.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)
3.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重25～28g。
3.4.2 劑量和給藥方法 小鼠隨機(jī)分5.0、10.0、20.0g/kg體重三個(gè)劑量組，一個(gè)陰性對(duì)照組（灌胃等容量蒸餾水）和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組（絲裂霉素C2.0mg/kg體重），每組10只。樣品以灌胃方式給予，連續(xù)5天，每天1次，對(duì)照組也相同處理。于首次灌胃后第35天脫臼處死，每組隨機(jī)選5只小鼠分別取兩側(cè)附睪，制成吸濾液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，用1%伊紅染色。
3.5 觀(guān)察指標(biāo) 高倍鏡下觀(guān)察精子形態(tài)并計(jì)數(shù)，每只小鼠計(jì)數(shù)完整精子1000條，計(jì)算精子畸形發(fā)生率（%）。
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠均未見(jiàn)明顯癥狀，也無(wú)死亡。三葉青對(duì)雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于100g/kg體重，屬實(shí)際無(wú)毒。
4.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠均未見(jiàn)明顯癥狀，也無(wú)死亡。三葉青對(duì)雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于40.0g/kg體重，屬實(shí)際無(wú)毒。
4.3 Ames試驗(yàn) 各菌株回變菌落數(shù)見(jiàn)表1。表1 三葉青Ames平扳摻入試驗(yàn)結(jié)果（略）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，不同濃度受試物在加和不加S 9 條件下的回變菌落與陰性對(duì)照組相近似，而陽(yáng)性對(duì)照回變菌落數(shù)均高于陰性對(duì)照回變菌落數(shù)2倍以上。說(shuō)明三葉青 Ames試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陰性。
4.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 三葉青對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響見(jiàn)表2。表2 三葉青對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響（略）注: * P<0.01（與陰性對(duì)照組比較）
用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，雌雄各劑量組與陰性對(duì)照組比較，微核千分率均無(wú)顯著性差異，而陽(yáng)性對(duì)照組微核率則顯著高于陰性對(duì)照組，其差異有顯著性（P<0.01）。說(shuō)明三葉青 對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率未見(jiàn)明顯影響。
4.5 小鼠精子畸形試驗(yàn) 三葉青對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響見(jiàn)表3。表3 三葉青對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響（略）注: * P<0.01（與陰性對(duì)照組比較）各劑量組與陰性對(duì)照組比較，小鼠精子畸形發(fā)生率均無(wú)顯著性差異，而陽(yáng)性對(duì)照組則明顯高于陰性對(duì)照組，其差異有顯著性意義（P<0.01）。說(shuō)明三葉青對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率未見(jiàn)明顯影響。
5 結(jié)論
三葉青按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版） 中“食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn):第一階段大鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死LD50），雌雄兩性別均大于100g/kg體重:小鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死量（LD50），雌雄兩性別均大于40.0g/kg體重，按急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定，屬實(shí)際無(wú)毒;第二階段Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明三葉青未顯示有致突變性。
作者單位:
1 310013浙江杭州，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
2 浙江杭州，武警浙江總隊(duì)機(jī)關(guān)門(mén)診部
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