葡萄胎組織MMPs與TIMPs表達(dá)及意義

【關(guān)鍵詞】  基質(zhì)金屬蛋白酶類 基質(zhì)金屬蛋白酶組織物抑制物 葡萄胎
 ［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the expressions of MMPs and TIMPs in hydatidiform mole and their clinical significance.MethodsThe mRNA expressions of MMPs and TIMPs were detected by RT?PCR in tissue of hydatidiform mole (n=35) including six malignant transformed mole and normal villi (n=18).ResultsThe ratios of MMP?9/TIMP?1 mRNA expressions were significantly higher in the malignant transformed mole than those in the nonmalignant one and normal villi（F=3.62,q=3.82,3.57,P<0.05）. The differences in expressions of MMPs and TIMPs were not significant in all cases (P>0.05). Positive correlation between MMP?7 and MMP?9 expression was noted (r=0.985,P<0.01).ConclusionIt is certain that the ratios of MMP?9/TIMP?1 mRNA expression plays a role in predicting malignancy of hydatidiform mole.
    ［KEY WORDS］matrix metalloproteinases; tissue inhibitor of matrixnetalloproteinases; hydatidiform mole
    葡萄胎屬于良性腫瘤，但是它具有潛在惡變的性能，雖然長期備受學(xué)者們的關(guān)注，但目前為止仍無理想的預(yù)測(cè)惡變的方法。雖然血絨毛膜促性腺激素（HCG）可作為一種較敏感的標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)葡萄胎的惡變，但是它有一定的滯后性。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中除多糖以外的所有成分,是調(diào)節(jié)ECM動(dòng)態(tài)平衡的最重要的一大酶系�；�質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs) 能與相應(yīng)的MMPs 酶原及其活化形式結(jié)合,從而抑制MMPs的活性及產(chǎn)生,阻止腫瘤發(fā)生惡變和轉(zhuǎn)移，因此，TIMPs的調(diào)節(jié)失衡在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移中可能起重要作用。本研究通過檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物MMP?7、MMP?9、TIMP?1及TIMP?2 mRNA在正常絨毛和葡萄胎組織中的表達(dá)水平，探討它們與葡萄胎惡變間的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。
    1  資料與方法
    1.1  一般資料
    35例葡萄胎病例均為2001年1月～2003年1月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院病人，經(jīng)病理檢查診斷為葡萄胎，清宮前均未進(jìn)行預(yù)防性化療；病人年齡22～36歲，中位年齡28歲；平均孕周為12周；隨訪期間有6例惡變?yōu)榍治g性葡萄胎，其診斷參照宋鴻釗[1]提出的侵蝕性葡萄胎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，列為葡萄胎惡變組（A組），其余病人作為萄胎未惡變葡組（B組）。18例行人工流產(chǎn)健康婦女作為對(duì)照組，隨訪后未發(fā)生滋養(yǎng)細(xì)胞疾病或持續(xù)性血HCG升高；病人年齡23～36歲， 中位年齡28歲；平均孕周為12周。
    1.2  方法
    1.2.1  新鮮標(biāo)本的收集與處理  所有標(biāo)本均在清宮時(shí)收集，取宮腔小水泡組織約0.5 g，置于 1.5 mL DEPC處理EP管中，立即置-79 ℃冰箱中備用。 
    1.2.2  RT?PCR方法  所有引物均由上海生工生物有限公司合成，以GAPDH為內(nèi)參照。組織樣本勻漿破碎后，按照Trizol（Invitrogen公司）說明提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品于波長260和280 nm處的吸光度，以觀察所提取RNA樣品的純度，并計(jì)算其含量；取1 g總RNA按照PromegaA3500逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA；取3 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2.5 μL buffer,1.5 μL MgCl2,0.5 μL dNTP,上下游引物各1.25 μL，Taq酶0.2 μL，最后加入去離子水至25 μL。開始94 ℃變性5 min，然后94 ℃預(yù)變性30 s；MMP?9、MMP?7、TIMP?1及TIMP?2分別行54、57、53、57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；取5 μL PCR產(chǎn)物，1 μL上樣緩沖液于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳60 min，在紫外線下凝膠成像。
    1.2.3  表達(dá)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)  PCR產(chǎn)物半定量分析,用天能GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描凝膠，進(jìn)行吸光度掃描和測(cè)定灰度值。以GAPDH 作為內(nèi)參照校正, 用目的基因與GAPDH灰度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。
    2  結(jié)    果
    2.1  MMPs與TIMPs mRNA在各組織中的表達(dá)
    2.1.1  RNA樣品鑒定  所提標(biāo)本的RNA濃度在0.5～5.0 g/L之間，A260/A280在1.8～2.0之間，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳RNA可見3條清晰的條帶（圖1～4）。
    2.1.2  MMPs與TIMPs mRNA在各組織中的相對(duì)表達(dá)  各組MMP?9、MMP?7、TIMP?1、TIMP?2的mRNA表達(dá)水平差異無顯著意義（P>0.05）。MMP?9/TIMP?1比值在各組中的表達(dá)差異有顯著性（F=3.62，P<0.05）；A組中MMP?9/TIMP?1比值分別高于B組和對(duì)照組，差異有顯著意義（q=3.82、3.57,P<0.05）。表1  各組組織中 MMPs與TIMPs mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
    2.2  各指標(biāo)間的相關(guān)性分析
    經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，在所有組織中MMP?9與MMP?7表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.985,P<0.01)，MMP?9與TIMP?1表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.616,P<0.01)。
    3  討    論
    預(yù)測(cè)葡萄胎是否惡變是葡萄胎治療中一個(gè)極為重要的問題，此問題長期以來備受學(xué)者們的關(guān)注，此方面的研究也不少，但仍無理想的預(yù)測(cè)惡變的方法。目前臨床上普遍將年齡大于40歲，清宮前子宮大于正常妊娠月份，卵巢黃素化囊腫直徑大于6 cm,清宮前血HCG>100 kU/L列為葡萄胎惡變的高危因素[2]，但不是惟一因素。當(dāng)存在上述惡變高危因素時(shí)，葡萄胎易發(fā)生惡變，但由于準(zhǔn)確性不高，影響到對(duì)預(yù)防性化療的評(píng)價(jià)。研究表明，滋養(yǎng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的侵入過程具有相似性，葡萄胎惡變?yōu)榍治g性葡萄胎的過程中，必須多次溶解血管內(nèi)皮基底膜，其中MMPs和TIMPs動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)在此過程中可能起到了非常重要的作用。已有學(xué)者研究了MMPs和TIMPs在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的作用，結(jié)果顯示，MMP?1/TIMP?1比例失衡使異位內(nèi)膜組織具有更強(qiáng)的侵襲能力，可能在該病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。
    本文研究結(jié)果顯示，MMP?9、MMP?7、TIMP?1、TIMP?2在各組中的表達(dá)均無顯著性差異，這可能是因?yàn)檎�常孕早期絨毛組織也可分泌MMPs,分解子宮內(nèi)膜基底膜,有利于胚泡植入和胎盤形成,同時(shí)又受到TIMPs在時(shí)間和空間上的嚴(yán)格限制；良性葡萄胎是局限在宮腔內(nèi)，并非浸潤，與正常絨毛侵蝕子宮內(nèi)膜過程相仿，因此，他們分泌的MMPs與TIMPs無差異性。而侵蝕性葡萄胎關(guān)鍵在于侵蝕，MMPs在其侵蝕過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，葡萄胎惡變組的MMPs與TIMPs雖略高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TIMP?1是MMP?9的特異性抑制因子。本研究結(jié)果顯示，MMP?9與TIMP?1呈正相關(guān)，說明隨著MMP?9表達(dá)的升高，TIMP?1表達(dá)也升高，而不是降低。因此，雖然MMPs與TIMPs分別在各組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MMP?9/TIMP?1比值在葡萄胎惡變組中的表達(dá)明顯高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組，差異有顯著性,而在正常絨毛組和葡萄胎未惡變組中的表達(dá)差異無顯著性。因此，可以認(rèn)為MMPs與TIMPs比例失衡即TIMP?1比值升高在葡萄胎的惡變過程中可能起重要作用。

   MMP?7又稱基質(zhì)溶解素。研究表明，MMP?7表達(dá)量的增高，不僅有助于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，還有助于腫瘤血管的形成[4]。由于滋養(yǎng)細(xì)胞可以取代血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管內(nèi)皮層， MMP?7在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的主要作用可能是協(xié)助滋養(yǎng)細(xì)胞取代血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血道轉(zhuǎn)移。MMP?7可以激活MMP?9，許多學(xué)者聯(lián)合這兩個(gè)指標(biāo)來檢測(cè)他們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。TANIOKA等[5]研究MMP?7、MMP?9與早期食管癌預(yù)后的相關(guān)性顯示，MMP?7的表達(dá)主要與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMP?9表達(dá)主要與腫瘤浸潤深度、淋巴浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期有關(guān)，在出現(xiàn)浸潤之前就有MMP?7、MMP?9的聯(lián)合表達(dá)可能與預(yù)后有關(guān)。MISUGI等[6]研究了MMPs和TIMPs在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，顯示MMP? 7在分級(jí)高的腫瘤中比分級(jí)低的腫瘤中表達(dá)高，在分級(jí)高的子宮內(nèi)膜癌中MMP? 7表達(dá)升高可能與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究經(jīng)相關(guān)性分析表明，MMP?7表達(dá)增多時(shí)，MMP?9表達(dá)也增多，這從基因水平表明了兩者呈正相關(guān)，且關(guān)系密切，在葡萄胎出現(xiàn)惡變之前就有MMP?7及MMP?9聯(lián)合表達(dá)升高，提示可能是葡萄胎惡變的早期表現(xiàn)。
    總之，本文通過比較各組中MMPs及TIMPs的mRNA表達(dá)水平顯示，雖然在有惡變傾向的葡萄胎中的表達(dá)均略高于良性葡萄胎和正常絨毛，但差異無顯著性；而MMP?9/TIMP?1比值在葡萄胎惡變組中的表達(dá)高于正常絨毛組和葡萄胎未惡變組,因此認(rèn)為MMP?9/TIMP?1比值可望作為判斷葡萄胎預(yù)后的一項(xiàng)參考指標(biāo)，特別是對(duì)葡萄胎有惡變傾向的病人進(jìn)行預(yù)防性化療可提供理論依據(jù)。
 
【參考文獻(xiàn)】
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