膝骨痹康袋泡熏洗劑提取工藝的優(yōu)化

　　【摘 要】目的：優(yōu)選用于膝骨關(guān)節(jié)炎的膝骨痹康袋泡熏洗劑的提取工藝。方法：采用L9(34)的正交試驗(yàn)法，利用高效液相色譜法和紫外分光光度法分別測(cè)定柚皮苷和烏頭堿的含量，并以干膏得率、柚皮苷含量和烏頭堿含量的加權(quán)綜合評(píng)分作為工藝篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察膝骨痹康袋泡熏洗劑制劑的水提取加水量、煎煮時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響，確定膝骨痹康袋泡熏洗劑的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果：膝骨痹康袋泡熏洗劑最優(yōu)提取工藝為15倍加水量，煎煮3次，每次1 h，驗(yàn)證3批所得樣品平均的干膏得率、柚皮苷含量和烏頭堿含量分別為20.73%、102.5 mg、22.4 mg，與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，達(dá)到優(yōu)化效果。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于膝骨痹康袋泡熏洗劑的工業(yè)化生產(chǎn)，為該制劑的進(jìn)一步研究奠定良好的基礎(chǔ)。

　　【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝;袋泡熏洗劑;提取工藝;正交優(yōu)化

　　膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)屬中醫(yī)學(xué)“膝骨痹”范疇，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人，女性多于男性。KOA的發(fā)生發(fā)展是一種長(zhǎng)期、慢性、漸進(jìn)的病理過(guò)程，對(duì)早、中期患者治療在于控制關(guān)節(jié)疼痛、延緩或阻斷殘疾進(jìn)展、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動(dòng)功能[1-3]。

　　作為傳統(tǒng)中藥外治法之一的熏洗法，具有理療和中藥的雙重治療作用，同時(shí)通過(guò)經(jīng)皮給藥可以避免肝臟的首關(guān)效應(yīng)及胃腸道影響，醫(yī)患均易于控制給藥并維持穩(wěn)定而持久的藥物濃度，在治療KOA方面取得良好的效果[4-6]。但熏洗過(guò)程中需要患者自行煎煮藥湯，較為費(fèi)時(shí)、繁瑣，極大地降低了患者依從性。膝骨痹康袋泡熏洗劑由骨碎補(bǔ)、制川烏、艾絨、紅花等藥材組成，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、通經(jīng)絡(luò)、強(qiáng)筋骨之功效，是臨床外用熏洗治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方，適用于肝腎氣血虛損、風(fēng)寒濕瘀痹阻為基本病機(jī)的KOA患者，對(duì)緩解疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)功能障礙等療效確切。

　　本研究擬將其改為袋泡熏洗劑，以君藥骨碎補(bǔ)中的藥效成分柚皮苷以及臣藥川烏中的烏頭堿為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)，開展袋泡熏洗劑提取工藝的優(yōu)化試驗(yàn)，為該制劑的新藥研制奠定基礎(chǔ)。

　　1 試驗(yàn)材料

　　1.1 試驗(yàn)儀器 雙光束紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6，國(guó)華電器有限公司);高效液相色譜儀(LC-20A，SPD-M20A PDA檢測(cè)器，LC-20AT四元梯度泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司);色譜柱(Diamonsil C18 5 u 250 mm×4.6 mm);萬(wàn)分之一電子分析天平(FA604A，上海精天電子儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-400E，昆山市超聲儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。 　　1.2 試驗(yàn)藥材 研究所需藥材購(gòu)于福建百晟藥業(yè)有限公司。槲寄生(產(chǎn)地河北，批號(hào)1406005);骨碎補(bǔ)(產(chǎn)地江西，批號(hào)1408005);續(xù)斷(產(chǎn)地湖北，批號(hào)1407007);伸筋草(產(chǎn)地江西，批號(hào)1405005);透骨草(產(chǎn)地湖南，批號(hào)1404004);海桐皮(產(chǎn)地貴州，批號(hào)1403003);艾絨(產(chǎn)地安徽，批號(hào)20140506);制川烏(產(chǎn)地四川，批號(hào)131101);制草烏(產(chǎn)地山西，批號(hào)131015);白芷(產(chǎn)地安徽，批號(hào)20140618);威靈仙(產(chǎn)地遼寧，批號(hào)1404004);川芎(產(chǎn)地四川，批號(hào)20140408);川椒(產(chǎn)地四川，批號(hào)140301);紅花(產(chǎn)地新疆，批號(hào)20140418)。

　　1.3 試驗(yàn)試劑 研究所需烏頭堿對(duì)照品(0720-9807)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，柚皮苷對(duì)照品(110722-201312)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。甲醇為色譜純，三氯甲烷、冰醋酸等試劑均為分析純。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 前期預(yù)試驗(yàn)以水為溶媒，對(duì)復(fù)方藥材進(jìn)行水提，并以柚皮苷及干浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對(duì)結(jié)果有明顯影響。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)并參考文獻(xiàn)[7]，本研究對(duì)加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)進(jìn)行正交試驗(yàn)考查，各因素?cái)M定3個(gè)水平，見表1。以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)3個(gè)因素為考察對(duì)象，以干浸膏得率、柚皮苷含量、烏頭堿含量的綜合評(píng)分作為確定最佳提取工藝的衡量指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，見表2。其中D列為自動(dòng)生成的誤差列，篩選最佳的提取工藝。柚皮苷(Ⅰ)和烏頭堿(Ⅱ)為復(fù)方中代表性的有效成分，選擇其作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)各定為0.4，而作為有效成分煎出間接控制的一個(gè)指標(biāo)，藥效物質(zhì)提取的多少可以從干膏得率(Ⅲ)的大小來(lái)判斷，權(quán)重系數(shù)定為0.2，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳工藝。準(zhǔn)確稱取除紅花外的復(fù)方藥材9份，每份158 g，按L9(34)正交試驗(yàn)所示條件提取，濾過(guò)，合并提取液，將其水浴蒸發(fā)濃縮，烘箱減壓干燥，得干浸膏作為各供試樣品備用。綜合評(píng)分=(Ⅰ/Ⅰmax×0.4 + Ⅱ/Ⅱmax×0.4 + Ⅲ/Ⅲmax×0.2)×100。

　　2.2 指標(biāo)測(cè)定

　　2.2.1 干浸膏得率的測(cè)定 提取液濃縮后置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置烘箱中減壓干燥至恒重，稱重。計(jì)算干浸膏得率，干浸膏得率(%)=干膏量/藥材總量×100%。結(jié)果見表2，方差分析見表3。

　　2.2.2 柚皮苷含量測(cè)定

　　2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 柚皮苷對(duì)照品精密稱定2.01 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度得對(duì)照品溶液，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為201 μg・mL-1。

　　2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取1.6 g各提取方法所得的干浸膏，至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，密塞，超聲10 min，靜置10 min，并用甲醇定容至刻度。取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液備用。按處方比例及工藝制備不含骨碎補(bǔ)的陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液。

　　2.2.2.3 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相乙腈∶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水= 19∶81;檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm;流速為1.0 mL・min-1，柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

　　2.2.2.4 專屬性考察 分別取2.2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液、2.2.2.2項(xiàng)下供試品液、陰性樣品溶液，按上述HPLC分析條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明，陰性樣品溶液在柚皮苷峰位處無(wú)干擾，證明此法具有良好的專屬性，見圖1。

　　2.2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg・mL-1，按2.2.2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得柚皮苷回歸方程為Y = 18 722 C-33 165(r = 0.999 9)，結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20.1～100.5 μg・mL-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

　　2.2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密稱取60.3 μg・mL-1柚皮苷對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算柚皮苷含量，結(jié)果RSD為0.99%，表明儀器精密度良好。

　　2.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，測(cè)定柚皮苷峰面積，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果RSD為1.59%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性好。

　　2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測(cè)定柚皮苷峰面積，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果RSD為1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知柚皮苷含量供試品溶液6份，分別加入同質(zhì)量的柚皮苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果表明，柚皮苷平均加樣回收率為107.4%，RSD為1.26%。

　　2.2.3 烏頭堿含量測(cè)定

　　2.2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定烏頭堿對(duì)照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解烏頭堿對(duì)照品，并定容至刻度，搖勻，即得100 μg・mL-1烏頭堿對(duì)照品溶液。

　　2.2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取8.05 g生藥量的9種正交試驗(yàn)方法所得的干浸膏量樣分別為0.95，1.35，1.65，1.1，1.35，1.0，1.2，0.8，1.25 g，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氨試液使?jié)駶?rùn)，靜置5 min，加三氯甲烷8 mL，渦旋5 min，3000 r・min-1的離心速度離心10 min，取下層，即得供試品溶液，紫外分光光度計(jì)在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在241 nm處有最大吸收。

　　2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.5，1，2，4，6 mL于10 mL的容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5，10，20，40，60 μg・mL-1。于241 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以三氯甲烷作為空白。以吸光度A值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)C為橫坐標(biāo)，得烏頭堿的線性方程為A = 0.008 1 C + 0.062 7(r = 0.998 1)，結(jié)果表明烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5～60 μg・mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　2.3 正交試驗(yàn)提取優(yōu)選結(jié)果 按照2.2.2與2.2.3項(xiàng)下的方法分別測(cè)定由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種提取方法而得的柚皮苷和烏頭堿的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，各因素影響提取效果的因素順序?yàn)镃 > A > B。表3與表4的方差分析結(jié)果表明，C對(duì)干浸膏得率的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。但3種因素對(duì)綜合評(píng)分的影響比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際情況，確定從柚皮苷含量、烏頭堿含量及干浸膏得率的綜合評(píng)分優(yōu)選出提取工藝為A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。

　　3 驗(yàn)證試驗(yàn)

　　為了驗(yàn)證上述結(jié)論的準(zhǔn)確性，按照最佳工藝條件A2B2C3進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果干浸膏得率、烏頭堿、柚皮苷含量平均值分別為20.73%、22.4 mg、102.5 mg，驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，證明該工藝穩(wěn)定可行。

　　4 討 論

　　本試驗(yàn)通過(guò)水提方法，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選，得最優(yōu)提取工藝為A2B2C3，即加15倍的水，煎煮3次，每次1 h。提取工藝簡(jiǎn)便、廉價(jià)，且工藝驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，該工藝穩(wěn)定，可行性高。在柚皮苷含量測(cè)定時(shí)，預(yù)試驗(yàn)通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)嘗試改變流動(dòng)相比例[8]，如流動(dòng)相乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水比例為20∶80和18∶82，發(fā)現(xiàn)樣品分離度和峰形較差，而調(diào)整流動(dòng)相乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水比例為19∶81，對(duì)照品和樣品得以較好分離，符合含量測(cè)定要求。這表明針對(duì)具體的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)于常規(guī)的檢測(cè)方案有時(shí)進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整是必要的。

　　中藥的提取工藝對(duì)保持中藥復(fù)方的療效具有直接影響，同時(shí)中藥的提取工藝路線應(yīng)與所選擇的劑型相關(guān)，適宜的提取工藝是中藥劑型改進(jìn)和創(chuàng)新的前提和基礎(chǔ)。為了發(fā)揮中藥復(fù)方整體效應(yīng)與綜合作用，使復(fù)方中多種成分同時(shí)提取，需要選擇一種可讓多種有效成分最大溶出的溶媒。本研究根據(jù)膝骨痹康袋泡熏洗劑的臨床用法特點(diǎn)及復(fù)方中中藥有效成分的特點(diǎn)，同時(shí)根據(jù)制劑工藝的可行性、經(jīng)濟(jì)性且易于產(chǎn)業(yè)化的考慮，對(duì)復(fù)方中除紅花以外的其他中藥進(jìn)行共煎水提。

　　合理選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳工藝條件，是中藥制造現(xiàn)代化研究的重要領(lǐng)域[9]。中藥袋泡熏洗劑指中藥材經(jīng)過(guò)一定的工藝制備后，裝入以纖維濾紙為包袋材料的袋中，再放于開水或熱水中浸泡使用的一種制劑。膝骨痹康袋泡熏洗劑共有14味中藥，共奏祛風(fēng)濕、止痹痛、通經(jīng)絡(luò)、強(qiáng)筋骨之功效。然而其中有效成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，根據(jù)文獻(xiàn)[10-13]復(fù)習(xí)及組方藥物特點(diǎn)，結(jié)合KOA肝腎氣血虛損、風(fēng)寒濕瘀痹阻的基本病機(jī)特點(diǎn)，本試驗(yàn)選取了該方中補(bǔ)肝腎、壯筋骨的君藥骨碎補(bǔ)及祛寒濕、止痹痛的臣藥制川烏的主要成分作為觀察指標(biāo)。骨碎補(bǔ)始載于《本草拾遺》，現(xiàn)代研究表明，骨碎補(bǔ)能增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、提高骨密度、維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度，是腎主骨生髓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[14]。骨碎補(bǔ)浸膏以水為溶劑時(shí)提取效果較好[15]，柚皮苷為一種雙二氫黃酮類化合物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的耐熱性，是骨碎補(bǔ)的主要活性物質(zhì)之一，有益于骨關(guān)節(jié)傷病的愈合[16];烏頭堿為制川烏的主要成分，故筆者選擇烏頭堿與柚皮苷的含量及復(fù)方浸膏得率的加權(quán)綜合評(píng)分作為膝骨痹康袋泡熏洗劑的提取評(píng)價(jià)指標(biāo)，這種評(píng)價(jià)相對(duì)較客觀可靠。

　　5 參考文獻(xiàn)

　　[1] 蔡建華，李建強(qiáng)，鄺錦波.白金膏治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(7)：1108-1110.

　　[2] 寇俊梓，李釗.中藥熏洗方治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].光明中醫(yī)，2014，29(4)：751-752.

　　[3] 汪利合，李慧英，趙鵬飛，等.消瘀定痛散外敷治療中重度膝骨關(guān)節(jié)炎36例[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2(12)：17-18.

　　[4] 陳海鵬，劉志坤.膝痛消熏洗方治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床療效評(píng)價(jià)[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2(4)：29-31.

　　[5] 苗明三，郭艷，尹俊濤.中藥外用研究的思路[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(10)：2574-2575.

　　[6] 許梅馨.海桐皮湯熏洗治療早、中期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎98例[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22(1)：34-35.

　　[7] 陳豐連，賈薇，曾元兒.影響骨碎補(bǔ)浸膏中柚皮苷含量的因素研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16(3)：210-211.

　　[8] 李遇伯，孟繁浩，潘曉峰，等.HPLC同時(shí)測(cè)定骨碎補(bǔ)藥材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(6)：808-810.

　　[9] 黃永亮，吳純潔，何曉燕.中藥提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究進(jìn)展[J].中藥與臨床，2012，3(5)：49-52.

　　[10] 景晶，曹紅.高效液相色譜法測(cè)定舒筋止痛酊中柚皮苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(1)：63-65.

　　[11] 區(qū)炳雄，鄧廣海，羅銳.川烏總生物堿含量測(cè)定[J].中藥材，2013，36(6)：946-947.

　　[12] 全維明，李博.高效液相色譜法測(cè)定骨質(zhì)增生散中柚皮苷的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(8)：1892-1893.

　　[13] 鐘國(guó)躍，于超，趙志禮.中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法新探――“有限成分組合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”論[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(9)：719-720.

　　[14] 趙剛，蔡定芳，董淑范，等.不同補(bǔ)腎法對(duì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠作用的比較研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2002，36(7)：44-47.

　　[15] 王允，劉毅，姚干.骨碎補(bǔ)提取與含量測(cè)定研究概況[J].中國(guó)藥業(yè)，2007，16(6)：63.

　　[16] 唐琪，陳莉麗，嚴(yán)杰.骨碎補(bǔ)提取物促小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和鈣化作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2004，29(2)：164-168.

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