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γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
【摘要】 目的了解地衣芽孢桿菌菌體細(xì)胞中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的一些基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)。方法 采用溶菌酶法破碎細(xì)胞壁，經(jīng)硫酸銨沉淀后透析得到粗酶后，采用紫外分光光度法測(cè)定該酶的酶活力。結(jié)果 該酶在25~35℃的溫度范圍有很好的耐受性，在堿性條件下保持一定的活性，最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，Ca2+ 、Mg2+等金屬離子在適當(dāng)濃度時(shí)對(duì)酶活性有促進(jìn)作用。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)為利用該酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;酶學(xué)性質(zhì);茶氨酸
Abstract:Objective To understand some basic properties ofγ-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis.Methods Lysozyme were used to disrupt the cell wall and ammonium sulfate were used to separate precipitation and dialysis,at last the crude enzyme were obtained. UV spectrophotometry were used to measured the enzyme activity. Results This enzyme was well tolerant to temperature in the range of 25~35 ℃,but in alkaline conditions,it maintained a certain activity,the optimum reaction temperature was 45 ℃ and optimum reaction pH 8.0,generally the appropriate concentration of metal ions,such as Ca2+,Mg2+,had a positive effect on the activity. Conclusion This experiment could be used in production of theanine with γ-glutamyltranspeptidase.
Key words: γ-glutamyltranspeptidase; enzymological property; L-theanine
γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC 2.3.2.2),又稱(chēng)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶,在生物體內(nèi)廣泛存在,是谷胱甘肽(GSH)代謝的關(guān)鍵酶之一。該酶還參與了氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),可特異性催化γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)[1]。人們對(duì)γ-GTP的早期研究局限于該酶在GSH代謝中所起的作用[2]。隨著研究的深入,人們對(duì)γ-GTP的催化功能和分子結(jié)構(gòu)有了更多的了解,并發(fā)現(xiàn)其在臨床上可作為肝膽疾病的生物標(biāo)志,被廣泛應(yīng)用于肝病及其他臟器疾病的診斷和預(yù)后檢測(cè)[3-4] 。近年來(lái),由于生物技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn),生物催化與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中逐漸興起,利用γ-GTP制備系列γ-谷氨酰基類(lèi)化合物的研究已成為生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。已有報(bào)道利用γ-谷氨�；�(γ-glutamylization)反應(yīng)合成了GG-DOPA等多種化合物[5-7]。目前，利用來(lái)源于枯草芽孢桿菌、基因工程改造的大腸埃希菌的γ-GTP生產(chǎn)茶氨酸[8] (L-theanine,γ-L-glu-ethylamide)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。該方法利用γ-GTP將L-谷氨酰胺上的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移到乙胺受體上,催化合成L-茶氨酸。但利用地衣芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)的γ-GTP轉(zhuǎn)化合成茶氨酸尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用實(shí)驗(yàn)室篩選的γ-GTP高產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶，并研究該菌株所產(chǎn)的γ-GTP的基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步利用地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的γ-GTP生產(chǎn)茶氨酸提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
菌種：地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。試劑：Tris 購(gòu)自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺、雙甘肽均購(gòu)自廣州威佳科技有限公司;硫酸銨為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶發(fā)酵
用接種環(huán)在活化好的菌種斜面上刮下一環(huán)菌種，將其轉(zhuǎn)入到種子培養(yǎng)基，30 ℃、240 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h。以20%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(30 mL發(fā)酵液/300 mL三角瓶)中，在30 ℃下240 r/min搖床培養(yǎng)28 h后收集菌體。
1.3γ-GTP粗酶的制備
γ-GTP發(fā)酵瓶培養(yǎng)液離心(4 800 r/min,10 min)，棄上清液，用TE緩沖液(Tri-HCl 緩沖液,pH 8.0，10 mol/L)重懸菌體,采用溶菌酶法以及硫酸銨鹽析法制備粗酶液。
1.4酶對(duì)溫度的耐受性
以TE pH8.0為緩沖液，不同溫度下保存20 min，測(cè)定酶活力[1]。
1.5酶對(duì)pH的耐受性
pH2.0采用Na2HP04檸檬酸緩沖液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液;pH7.0采用磷酸鹽緩沖液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液;在25 ℃下保存30 min，測(cè)定酶活力。
1.6酶的最適反應(yīng)溫度
以TE pH8.0為緩沖液，分別在不同溫度下測(cè)定酶活力。
1.7酶的最適反應(yīng)pH
pH2.0采用Na2HP04-檸檬酸緩沖液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc緩沖液;pH7.0采用磷酸鹽緩沖液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl緩沖液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH緩沖液，采用酶活測(cè)試方法檢測(cè)酶活力。
1.8金屬離子對(duì)酶活力的影響
在反應(yīng)體系中分別加入各種金屬離子，終濃度均為5 mmol/L，采用酶活測(cè)試方法檢測(cè)酶活力。
2結(jié)果
2.1酶對(duì)溫度的耐受性
γ-GTP對(duì)40 ℃及以上溫度的耐受性較差，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，經(jīng)過(guò)短時(shí)間的保存,酶活力基本喪失。但在25~35℃的溫度范圍有較好的穩(wěn)定性，特別是在常溫下，經(jīng)過(guò)20 min的保藏，酶活力基本未變。因此該酶的保藏條件比較簡(jiǎn)單，適合工業(yè)生產(chǎn)茶氨酸。見(jiàn)圖1。[PSc1781;S*2〗圖1γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶對(duì)溫度的耐受性Figure 1Temperature tolerance of γ-GTP
2.2酶對(duì)pH的耐受性
γ-GTP對(duì)酸性環(huán)境的耐受性很差，在pH低于5.0時(shí)，短時(shí)間保存后酶活力基本喪失，而在堿性條件下，最高可以耐受pH11.0的環(huán)境而保持較高的酶活力。其中pH8.0是其最佳的保藏pH。因此可以選用pH8.0的緩沖液保存該酶。見(jiàn)圖2�！ PSc1782;S*2〗圖2γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶對(duì)pH的耐受性Figure 2Tolerance to pH of γ-GTP
2.3酶的最適反應(yīng)溫度
γ-GTP對(duì)溫度的適應(yīng)性很強(qiáng)，在37~55℃以下均具有較高的酶活力，其中在45 ℃時(shí)酶活力最高。因此可以確定按照γ-GTP酶活力檢測(cè)方法得到γ-GTP的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。見(jiàn)圖3。
2.4酶的最適反應(yīng)pH值
γ-GTP對(duì)酸性環(huán)境適應(yīng)力很差，而在弱堿性條件下表現(xiàn)出較高的酶活力，其中在pH8.0時(shí)酶活力最高。因此可以確定按照γ-GTP酶活力檢測(cè)方法得到γ-GTP的最適反應(yīng)pH為8.0。見(jiàn)圖4。
2.5金屬離子對(duì)酶活力的影響
在反應(yīng)體系中加入5 mmol/L的各種金屬離子除亞錫離子外均會(huì)對(duì)酶的活力有促進(jìn)作用。但在金屬離子中，一價(jià)金屬離子鉀離子和鈉離子以及三價(jià)金屬離子鐵離子和鋁離子的加入對(duì)酶的促進(jìn)作用明顯低于二價(jià)金屬離子錳離子、鈣離子和鎂離子。另外，添加重金屬離子亞錫離子由于會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，致使酶活力消失;有的金屬離子如錳離子、鎂離子等可較大程度的提高酶活力，這可能是由于這些金屬離子會(huì)對(duì)γ-GTP的活性中心產(chǎn)生影響的緣故。見(jiàn)圖5。[PSc1783;S*2〗圖3γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶最適反應(yīng)溫度Figure 3Optimum reaction temperature for γ-GTP[PSc1784;S*6/7〗圖4γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶最適反應(yīng)pH Figure 4The optimum reaction pH for γ-GTP[PSc1785;S*2〗圖5不同金屬離子對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活力的影響Figure 5Effects of various metal ions on the activity of γ-GTP
在一般情況下，適合的金屬離子及適合的濃度會(huì)對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，但如果反應(yīng)體系中金屬離子濃度過(guò)高，反而會(huì)對(duì)酶蛋白產(chǎn)生毒害作用。為此，可選擇對(duì)γ-GTP影響較大的鎂離子研究濃度與酶活力的關(guān)系。
Mg2+濃度對(duì)酶活力的影響比較顯著。在低于3.0 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，酶活力隨著Mg2+濃度的增加而增高，當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mmol/L時(shí)酶活力最高，此后，酶活力隨著Mg2+濃度上升而緩慢下降。由此可見(jiàn)，在圖5所涉及的金屬離子(除亞錫離子外)雖然在5 mmol/L的濃度下對(duì)酶活力均有促進(jìn)作用，但在不同濃度下有些金屬離子也會(huì)對(duì)酶起到抑制作用。見(jiàn)圖6�！ PSc1786;S*2〗圖6鎂離子濃度對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力的影響Figure 6Effects of Mg2+ concentration on γ-GTP
3討論
地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的γ-GTP在25~35 ℃的溫度范圍有較好的穩(wěn)定性，在50 ℃的溫度下保存20 min酶活力基本喪失，這為進(jìn)一步利用該酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸時(shí)的溫度條件提供了依據(jù)。該酶對(duì)酸性環(huán)境無(wú)耐受性，適宜在堿性條件下保存，在pH低于11的堿性條件下保存30 min，酶活力基本無(wú)損失。利用γ-GTP生產(chǎn)茶氨酸需要反應(yīng)體系pH 為10[9]，而該酶在此pH下比較穩(wěn)定，說(shuō)明地衣芽孢桿菌所產(chǎn)生的 γ-GTP適合于酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸。
按照γ-GTP酶活力檢測(cè)方法得到地衣芽孢桿菌所產(chǎn)γ-GTP的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適合反應(yīng)pH為8.0，在金屬離子濃度為5 mmol/L的情況下，鉀離子、鈣離子和鎂離子等金屬離子對(duì)酶的活力均無(wú)傷害，其中有些金屬離子(Mn2+,Ca2+)的存在對(duì)酶活力促進(jìn)作用較大(見(jiàn)圖5)，在酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸選擇合適的離子濃度對(duì)酶活力的提高有較大的促進(jìn)作用，如當(dāng)鎂離子濃度為3.0 mmol/L時(shí)酶活力提高了55.9%。
本文僅對(duì)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基礎(chǔ)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，有關(guān)催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以及利用該酶生產(chǎn)茶氨酸的合適工藝條件還有待進(jìn)一步的探討。
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