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反相高效液相色譜法測定尿液4種腎病標志物
作者：孔宇，趙永席，王波，吳紅，馬國營
【關(guān)鍵詞】 糖尿病腎病
Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine
【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN), creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer ［consisted 30%(V/V) methanol］ as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L, 10-200 μmol/L, 1-30 μmol/L, 10-1500 μmol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.
【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine
【摘要】 目的：建立糖尿病患者尿液中與腎病相關(guān)的非蛋白氮代謝產(chǎn)物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色譜分離分析方法. 方法：采用Agilent C18（200 mm×4.6 mm, 內(nèi)徑5 μm）色譜柱，流動相含30％(體積比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，流速0.9 mL/min，檢測波長200 nm，柱溫為室溫. 結(jié)果：在5 min內(nèi)可對患者尿液中上述4種物質(zhì)同時進行測定，樣品前處理簡單，重現(xiàn)性較好(遷移時間和峰面積的RSD均≤3%)，線性范圍較寬（肌酸：5~300 μmol/L, 肌酐：10~200 μmol/L, 尿素：1~30 mmol/L, 尿酸：10~1500 μmol/L）. 結(jié)論：此法完全適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.
【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜；糖尿病腎�。环堑鞍椎�；尿樣
0引言
糖尿病并發(fā)腎病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人們的廣泛關(guān)注. 非蛋白氮代謝產(chǎn)物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是與DN相關(guān)的幾種物質(zhì). 已報道的有關(guān)這些物質(zhì)的分離分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色譜法［3-6］、毛細管電泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能測定單一的物質(zhì)，而且尿液中的一些內(nèi)源性物質(zhì)對測定有干擾；液相色譜法則多集中在對某一種或部分物質(zhì)的測定上；毛細管電泳測定這些標志物重現(xiàn)性有待于提高. 我們運用反相高效液相色譜法，對DN患者尿液中與DN相關(guān)的Cr, Cn, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物進行同時分離檢測. 同時測定尿液中的4種物質(zhì)目前還未見報道. 此法具有快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，完全可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.
1和方法
1.1材料Agilent 1100液相色譜儀（美國Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均購自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇為色譜純試劑（天津第二化學(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純，水為二次重蒸水.
1.2方法
1.2.1色譜條件色譜柱為Agilent C18柱（200 mm×4.6 mm,內(nèi)徑5 μm），流動相含體積比為30%的甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，等度洗脫，流速0.9 mL/min，檢測波長200 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL.
1.2.2標準溶液的配置和尿樣的處理方法Cr, Cn和U標準溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸鉀，溶解在40 mL重蒸水中，加熱至60℃，使其完全溶解，精確稱取Ua 28 mg,溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存. 尿液樣品的處理方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用. 所有溶液每周更換1次，使用前均過0.45 μm的水相膜后再用于色譜分析.
2結(jié)果
2.1色譜條件的優(yōu)化固定其它色譜條件不變，分別改變緩沖液的pH值、流動相（pH 6.86）中甲醇比例、流動相中緩沖液濃度和流動相的流速，考察了其對4種物質(zhì)分離的影響. 四種物質(zhì)的分離隨pH、甲醇比例、磷酸緩沖液濃度和流動相的流速的變化情況分別如圖1，2所示.
A：流動相pH；B：甲醇比例.
圖1流動相pH和甲醇比例對幾種標志物保留時間的影響（略）
A：磷酸緩沖液濃度；B：流速. R12: U和Cr之間的分離度; R23: Cr和Ua之間的分離度; R34: Ua和Cn之間的分離度.
圖2流動相中磷酸緩沖液濃度以及流速對分離的影響（略）
2.2方法重現(xiàn)性在選定的色譜條件下，連續(xù)5次測定了同一樣品，對各物質(zhì)的遷移時間、峰面積和峰高的重現(xiàn)性進行了考察，結(jié)果表明,各物質(zhì)的遷移時間的變化很�。ūＡ魰r間的RSD值見表1），方法的重現(xiàn)性較好.
2.3定量標準曲線、回收率以及最低檢測限配置一系列濃度的標準溶液，按上述色譜條件進行分析測定，將所測的峰面積對物質(zhì)的濃度作回歸分析，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9992；以信噪比(S/N)為3來測定檢測限；添加已知量標樣，測定其含量，計算方法的回收率(表1).
表1方法的相關(guān)參數(shù)（略）
2.4樣品分析在選定的色譜條件下，對標準溶液和實際DN尿樣進行了分析，5 min內(nèi)4種物質(zhì)即可達到完全分離，分離結(jié)果如圖3所示，實際DN尿樣中的4種物質(zhì)得到了很好的檢出，尿樣里的其他物質(zhì)對分析無干擾. 采用此法對某糖尿病患者以及正常人尿樣中的Cn, Cr, U，Ua分別進行測定，結(jié)果糖尿病患者尿樣中Cn, Cr, U，Ua的含量分別為10.3, 0.68, 26.7，2.1 μmol/mL, 正常人尿樣中的Cn, U，Ua的含量分別為7.7, 36.7，1.0 μmol/mL,而Cr未被檢出.
圖3標準溶液(A)和尿樣(B)的色譜圖（略）
3討論
3.1pH對分離的影響其從圖1A中可以看出，在pH 3.5~7.5范圍內(nèi)U和Cr的出峰時間和順序幾乎不隨pH的變化而變化；而對于Cn和Ua來說，其出峰時間和順序都隨pH的變化而變化，當(dāng)pH接近5.5時，兩者的出峰時間近乎相同，得不到分離. 因此，在選擇最佳pH時，主要考慮Cn和Ua之間的分離度（Rs）以及分析的效率（分析周期短），最終選擇緩沖能力最強，分離度較佳（Rs＝4.1）的pH 6.86為優(yōu)化的分離pH.
3.2流動相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出，隨著流動相中甲醇比例的增加，各標志物的出峰時間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時各標志物間的分離度也相應(yīng)減少，當(dāng)流動相中甲醇的比例大于40％時，各物質(zhì)幾乎同時被洗脫出來，難以達到分離. 最終選擇流動相中甲醇含量為30％為較佳的比例（此時分析周期較短，各物質(zhì)間分離度均大于2.0）.
3.3流動相中緩沖液濃度對分離的影響從圖2A中可以看出，隨著緩沖液濃度的增加，各標志物的峰面積隨之減小. 而緩沖液濃度為5和10 mmol/L時峰面積比較接近，最終選擇緩沖能力較強的10 mmol/L為最佳緩沖液濃度.
3.4流速的優(yōu)化從圖2B中可以看出，當(dāng)流速從0.4 mL/min增加到0.9 mL/min時，各物質(zhì)間的分離度是逐漸增加的，并且分析周期變短；而當(dāng)流速從0.9 mL/min增加到1.0 mL/min后 ，雖然分析效率有所提高（分離周期從4.8 min減少到4.0 min），但各物質(zhì)間的分離度卻有所減�。ù藭r的柱壓也過高：93.1 bar）. 最終選擇0.9 mL/min為最佳流速.
3.5測定結(jié)果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測定的結(jié)果可以看出，Cn，Cr和Ua在糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人（患者尿樣中Cr的含量遠遠高于正常人尿液中Cr的含量）；而患者尿樣中U的含量反而有所降低. 這些都說明患者腎功能已經(jīng)出現(xiàn)異常，非蛋白氮代謝產(chǎn)物不能很好的排出體外（對Cr的排泄率增加，而U排泄率降低），這也從一個側(cè)面證實了患者的腎臟已經(jīng)有了一定程度的損壞.
傳統(tǒng)的分析方法的干擾因素較多，分離效率和靈敏度較差，而采用的此法可在5 min內(nèi)同時測定糖尿病腎病尿樣中的Cn, Cr, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物. 此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，完全可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.
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