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痛平膏主要藥理作用實(shí)驗(yàn)研究
曹春然，周建平，王志斌 【摘要】 目的 觀察痛平膏的主要理作用，為應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 用熱板法、醋酸法致疼痛小鼠模型，觀察其鎮(zhèn)痛作用；用角叉菜膠、二甲苯致大、小鼠急性炎癥模型，考察其抗炎作用；采用葡聚糖致微循環(huán)障礙小鼠模型，研究痛平膏的活血作用。結(jié)果 痛平膏可提高動(dòng)物因熱刺激致痛的痛閾值，減少因醋酸刺激而發(fā)生扭體反應(yīng)的動(dòng)物只數(shù)；對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹有抑制作用，可減輕二甲苯致小鼠耳腫脹的腫脹度；對(duì)靜脈注射葡聚糖溶液引起的小鼠微循環(huán)障礙，有明顯的改善作用。結(jié)論 痛平膏具有鎮(zhèn)痛、抗炎和活血的藥理作用。【關(guān)鍵詞】 痛平膏； 鎮(zhèn)痛作用； 抗炎作用； 活血作用
【Abstract】 Objective To study the principal pharmcodynamics of Tongping ointment and provide experimental data for clinical application. Methods Methods of acetic acid-induced writhing and hot-plate test in mice were used to study the analgesic effect. Models of acute inflammatory reactions of xylene-induced mouse ear edema and carrageen-pastern-induced rat paw edema were performed to study the anti-inflammatory effects. To prepare the model of mouse ears microcirculatory disturbance by intravenous injection of dextran solution for observing promoting blood circulation effect of Tongping ointment. Results The pain threshold was remarkably improved and the number of writhing mice induced by acetic acid were decreased. Tongping ointment significantly suppressed carrageen-pastern-induced rat paw edema and xylene-induced mouse ear edema. The microcirculatory disturbance induced by injecting dextran solution was ameliorated markedly. Conclusion Tongping ointment manifested analgesic effect，anti-inflammatory and promoting blood circulation effects obviously.
痛平膏是由骨碎補(bǔ)、防風(fēng)、乳香、沒(méi)藥等多味組成的外用中藥復(fù)方制劑。具有舒筋活血、祛風(fēng)散寒、消腫止痛的功效。臨床可用于頸椎、關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕痛、骨質(zhì)增生痛等癥。為獲得臨床用藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，采用動(dòng)物模型觀察其鎮(zhèn)痛、抗炎和活血作用。
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1.1 動(dòng)物 SD品系大鼠，SPF級(jí)，♂，140±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2002－0003；ICR品系小鼠，SPF級(jí)，♀♂，體重19±1g、28±1g（♂，用于抗炎試驗(yàn)），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；昆明種小鼠，SPF級(jí)，♀♂，體重19±1g，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，許可證號(hào)：SCXK 11－00－0010。
1.2 藥品、試劑 痛平膏，批號(hào)：020801，由北京百草藥業(yè)提供；扶他林乳劑，批號(hào)：01193，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)；酸痛靈噴劑，批號(hào)：XSH00200，廈
1.3 儀器 熱板測(cè)痛儀，型號(hào)：GJ-8402 ，由浙江寧海白石儀器廠生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，型號(hào)：XSZ-H，重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
2 方法及結(jié)果
2.1 分組及給藥 動(dòng)物分為痛平膏大、中和小劑量組、空白對(duì)照組、酸痛靈噴劑組、扶他林乳劑組。痛平膏各組劑量分別為0.36、0.18和0.09g生藥/cm2，酸痛靈噴劑組為0.36ml/cm2，扶他林乳劑組為0.1g/cm2，空白對(duì)照組給予生理鹽水。
2.2 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)
2.2.1 對(duì)熱板法致小鼠疼痛的影響［1］ 因雄性小鼠受熱陰囊觸及熱板，可出現(xiàn)假性結(jié)果，所以本試驗(yàn)采用雌性小鼠。本次試驗(yàn)采用一次性給予動(dòng)物供試品及對(duì)照品，觀察其藥理作用。
取體重為19±1g的ICR種小鼠，♀，健康。試驗(yàn)前1日，先篩選合格小鼠，每次1只放在加熱至恒溫的鐵板（55℃）上，小鼠自放在熱板上，至出現(xiàn)因熱刺激而舔后足所需的時(shí)間（s），作為該鼠的痛閾值，出現(xiàn)舔足反應(yīng)后將小鼠取下。凡舔后足時(shí)間小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用。間隔1h，重復(fù)測(cè)定其正常痛閾值，取兩次正常痛閾平均值，作為該鼠的給藥前基礎(chǔ)痛閾值，以平均值不超過(guò)30s為合格。將合格小鼠隨機(jī)分為6組，并將小鼠背部的被毛去除（面積約1cm2）。試驗(yàn)當(dāng)日，將適量供試品及對(duì)照品涂抹于橡皮膏上，固定在小鼠的背部，以不影響其舔后足為度。在給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)，將小鼠放在加熱至恒溫（55℃）的鐵板上，觀察其發(fā)生因熱刺激而出現(xiàn)的舔足反應(yīng)時(shí)間，小鼠出現(xiàn)舔足反應(yīng)后，迅速將小鼠取下，以避免燙傷。痛閾值測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為給藥后0.5、1、2、4、6h。本試驗(yàn)觀察受試物的鎮(zhèn)痛作用及時(shí)效關(guān)系。以受試動(dòng)物出現(xiàn)因熱刺激而舔后足反應(yīng)的時(shí)間（痛閾值）為觀察指標(biāo)，對(duì)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t進(jìn)行。同時(shí)按下式計(jì)算各劑量組動(dòng)物鎮(zhèn)痛百分率。結(jié)果見(jiàn)表1。
鎮(zhèn)痛百分率=給藥組動(dòng)物痛閾值-空白對(duì)照組動(dòng)物痛閾值〖〗空白對(duì)照組運(yùn)動(dòng)痛閾值×100%
表1 痛平膏對(duì)熱板法致小鼠疼痛模型的影響 (x±s，n=10)
注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，括號(hào)內(nèi)為各給藥組動(dòng)物的鎮(zhèn)痛百分率。
2.2.2 對(duì)醋酸致小鼠疼痛的影響［1］ 取體重為19±1g的ICR種小鼠，♀♂，健康，共84只。本次試驗(yàn)采用一次性給予動(dòng)物供試品及對(duì)照品，觀察其藥理作用。試驗(yàn)前1日，將受試動(dòng)物的腹部被毛去除（面積約1cm2）。試驗(yàn)當(dāng)日，按體重隨機(jī)分成6組，涂抹于橡皮膏上，固定在小鼠的腹部，給藥1h后，將橡皮膏去除，避免影響小鼠的扭體反應(yīng)。用生理鹽水新鮮配置0.6％的醋酸溶液，按0.1ml/10g的劑量，腹腔注射給予小鼠。以給予醋酸后15min內(nèi)，各組受試動(dòng)物出現(xiàn)扭體反應(yīng)的只數(shù)為觀察指標(biāo)，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，與模型對(duì)照組比較，組間差異是否有顯著性。同時(shí)按下式計(jì)算各劑量組動(dòng)物的扭體反應(yīng)發(fā)生率和鎮(zhèn)痛百分率。結(jié)果見(jiàn)表2。
扭體反應(yīng)發(fā)生率=發(fā)生扭體反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)〖〗該組動(dòng)物的總數(shù)×100%
鎮(zhèn)痛百分率=模型對(duì)照組扭體反應(yīng)鼠數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)鼠數(shù)〖〗模型對(duì)照組扭體反應(yīng)鼠數(shù)×100%
表2 痛平膏對(duì)醋酸致小鼠疼痛模型的影響 （n=14）
注：與模型對(duì)照組比較。
2.3 抗炎試驗(yàn)
2.3.1 對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響［2］ 因目前不能確證性別對(duì)炎癥模型的影響，且雌激素有抗炎和免疫抑制作用，故選擇雄性大鼠作為本試驗(yàn)的受試動(dòng)物。取體重為140±10g的SD種大鼠，♂，健康，共50只。試驗(yàn)前1日，將試驗(yàn)用大鼠右后腿內(nèi)側(cè)的被毛去除（面積約1cm2）。試驗(yàn)當(dāng)日，按體重隨機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組，扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組、小劑量組。分別測(cè)量每只大鼠右后肢正常踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，作為造模前的基礎(chǔ)值。測(cè)量正常周長(zhǎng)后，在右后肢的內(nèi)側(cè)皮膚，分別給予各組動(dòng)物適量受試品和對(duì)照品，用橡皮膏固定。給藥30min后，分別在大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜混懸液0.1ml/只致炎。在致炎后1、2、4、6h，各測(cè)量一次右側(cè)踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)。以各組動(dòng)物致炎后與致炎前的踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)之差（腫脹度）為觀察指標(biāo)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，按下式計(jì)算腫脹抑制率。結(jié)果見(jiàn)表3。
腫脹抑制率=模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹率〖〗模型對(duì)照組平均腫脹度×100%
表3 痛平膏對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響 (x±s，n=10)
注：與模型對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，括號(hào)內(nèi)為各給藥組動(dòng)物的腫脹抑制率，“-”表示腫脹度大于模型對(duì)照組。
2.3.2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響［2］ 取體重為28±1g的ICR種小鼠，♂，健康，共60只。試驗(yàn)當(dāng)日，按體重隨機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組，扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組、小劑量組。每鼠左耳外側(cè)涂100％二甲苯0.02ml致炎，致炎后30min，在致炎的左耳內(nèi)側(cè)，涂抹適量受試品和對(duì)照品。致炎2h后，將小鼠斷頸處死，清理剩
余物，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用天平稱重。以每鼠的左耳片與右耳片重量之差（腫脹度）為觀察指標(biāo)，采用t進(jìn)行數(shù)據(jù)，與模型對(duì)照組比較組間差異的顯著性。按下列公式計(jì)算腫脹抑制率。結(jié)果見(jiàn)表4。
腫脹抑制率=模型對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度〖〗模型對(duì)照組平均腫脹度×100%
表4 痛平膏對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （x±s，n=10）
注：與模型組比較**P<0.01
2.4 活血作用試驗(yàn)［1］ 取體重為19±1g的昆明種小鼠，雌雄各半，健康，共60只。試驗(yàn)共分6組，空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，痛平膏扶他林乳劑組，痛平膏大劑量組、中劑量組和小劑量組。試驗(yàn)前1日，將受試小鼠的背部被毛去除（面積約1cm2）。試驗(yàn)當(dāng)日，分別給予適量的受試品和對(duì)照品，用橡皮膏固定在背部。給藥30min后，用1％戊巴比妥鈉溶液0.05ml/10g腹腔麻醉。剪去耳廓背側(cè)的細(xì)毛，并將小鼠腹部向下固定在顯微鏡的載物臺(tái)上，使鼠耳固定，調(diào)節(jié)顯微鏡（放大倍數(shù)為10×10），直至可以清楚地觀察小鼠耳廓微循環(huán)情況。固定視野，調(diào)節(jié)測(cè)微尺的位置，使其可以測(cè)量血管直徑的變化。給藥35min時(shí)，觀察小鼠耳廓選定部位的微小動(dòng)、靜脈的管徑，此測(cè)定值為造模前基礎(chǔ)值（A、V），并選擇血液流態(tài)相似的微小靜脈，用于觀察造模后血液流態(tài)的改變。給藥40min時(shí)，除空白對(duì)照組動(dòng)物外，均按0.3ml/20g的劑量從尾靜脈注射葡聚糖溶液（25mg/ml），空白對(duì)照組給予同體積生理鹽水注射液。分別在造模后10、20、30min時(shí)，連續(xù)觀察小鼠耳部選定的同一位置，記錄微動(dòng)、靜脈管徑及血液流態(tài)的變化。以各組動(dòng)物造模前與造模后的微動(dòng)、靜脈管徑的差值（△A、△V）為觀察指標(biāo)，同時(shí)對(duì)微靜脈血液的流態(tài)進(jìn)行評(píng)分，并作為觀察指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表5
表5 微靜脈血液的流態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
分值流態(tài)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)4分線粒流血流快速，成直線，但有沙粒感3分粒線流血流較快，成直線，但明顯有沙粒感2分粒流血流快，成直線，可區(qū)分細(xì)胞1分粒緩流血流緩慢，明顯區(qū)分細(xì)胞�？梢�(jiàn)細(xì)胞團(tuán)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 痛平膏對(duì)葡聚糖溶液致小鼠耳廓微循環(huán)障礙的影響 （x±s，n=10，μm）
注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01
注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01
3 討論
炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，其局部特征是紅、腫、熱、痛和功能障礙。為研究痛平膏的主要的作用，本實(shí)驗(yàn)分別采用鎮(zhèn)痛、抗炎和微循環(huán)障礙的經(jīng)典動(dòng)物病理模型進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛平膏可提高動(dòng)物因熱刺激致痛的痛閾值，減少因醋酸刺激而發(fā)生扭體反應(yīng)的動(dòng)物只數(shù)；對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹有抑制作用，可減輕二甲苯致小鼠耳腫脹的腫脹度；對(duì)靜脈注射葡聚糖溶液引起的小鼠微循環(huán)障礙，有明顯的改善作用。痛平膏對(duì)動(dòng)物炎癥、疼痛模型和微循環(huán)障礙模型均具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和活血作用，為臨床用于炎癥反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
痛平膏是外用制劑，其吸收方式和作用時(shí)間與常用的口服制劑有較大的區(qū)別，為獲得較完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)中盡量測(cè)定其作用時(shí)間，以獲得時(shí)－效曲線，供臨床使用參考。
【參考文獻(xiàn)】
1 陳奇.藥理實(shí)驗(yàn)研究方.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993，360－361；377－378；502－503.
2 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理試驗(yàn)方法學(xué)，第3版.北京： 人民衛(wèi)生出版社，2002，911-913.
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