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濱州市部分地面水體細菌耐藥性分析
【摘要】 目的 為了了解濱州市內(nèi)地面水體中細菌的耐藥性，并探討其與耐藥質(zhì)粒譜之間的關(guān)系。方法 采集濱州市內(nèi)4個地面水體的水樣，分別檢測水樣菌落形成單位(colonyforming unit，CFU)以及氨芐青霉素耐藥率，用KB法對氨芐青霉素耐藥菌株分別做7種不同抗生素的藥敏試驗，然后提取這些菌株的質(zhì)粒，用EcorI酶切質(zhì)粒電泳后分析酶切質(zhì)粒譜。結(jié)果 樣本氨芐青霉素耐藥率達11?7%~49?8%。氨芐青霉素耐藥菌株對其他3種不同的抗生素分別有12?5%~25%不等的耐藥性，未找到耐西拉司丁鈉的菌株。耐氨芐青霉素以及一種非β內(nèi)酰胺類抗生素的菌株占32?5%，耐氨芐青霉素以及兩種或者以上的非β內(nèi)酰胺類抗生素的菌株占20%。酶切質(zhì)粒譜共找到從815 bp~12?2 kb的63種大小不等的酶切片斷。結(jié)論 濱州市地面水體中細菌耐藥性普遍存在，且多重耐藥性明顯;對細菌耐藥性的監(jiān)測是十分有意義而且有必要的。
【關(guān)鍵詞】 地面水體;細菌耐藥性;質(zhì)粒譜
【Abstract】 Objective To survey the condition of antibiotic resistance in ground water body of Binzhou, and to study its relationship with plasmid profiles.Methods Water samples were collected from 4 places of ground water body of Binzhou, then CFU was counted and the antibiotic resistance rate was analyzed. KB method was used to practice the susceptibility test with 5 antibiotics, then the antibiotic resistance spectrums were analyzed.Results The ampicillin resistance rate of the samples varies from 11?7% to 49?8%. The ampicillin resistant isolates have different antibiotic resistance rate which varies from 12?5% to 25% relevant to 3 other antibiotics，and the cilastain resistance was not found . Isolates with the trait of ampicillin resistance and one nonβlactam antibiotic reached 32?5%, and isolates with the trait of resistant to ampcillin and two or more nonβlactam antibiotics reached 20%. There are 63 plasmids bands which varys from 815bp to 12?2kb in plasmid profiles.Conclusion The antibiotic resistance in ground water body of Binzhou was prevalent, and the phenomenon of multidrug resistance is obvious too. It is significant and necessary to monitor the antibiotic resistance status .
【Key words】 ground water body, drug resistance of bacteria, multidrug resistance
在自然界中，細菌的耐藥性是普遍存在的。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中抗生素的大量使用，在自然選擇壓力下，細菌的耐藥性也越來越強，再加上耐藥基因的傳代、轉(zhuǎn)移、擴散，耐藥菌越來越多，耐藥程度不斷增加，形成高度和多重耐藥。大量研究表明質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移在細菌多重耐藥性的形成中起了重要作用[1]。通過這種水平轉(zhuǎn)移，細菌的耐藥性擴散迅速、廣泛，耐藥株可自身克隆擴散，也可與敏感株進行遺傳物質(zhì)交換。這種現(xiàn)象在自然水體中廣泛地存在，這使多重耐藥性成為一個世界范圍內(nèi)的問題，造成和加劇了對新的抗菌藥物的需求。本課題的研究目的就是要了解濱州市部分地面水體中細菌耐藥性的特點，并分析該地區(qū)細菌耐藥性與細菌質(zhì)粒譜的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 主要試劑 常規(guī)LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基。Mueller Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片、0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿荣徸院贾萏旌臀⑸镌噭┯邢薰尽Ｙ|(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922由浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科細菌室提供。
1.2 主要儀器 普通超凈工作臺，柯達電子成像和分析系統(tǒng)120(柯達公司)，Gelpro Analyzer 4?0(Media Cybernetic公司)。
1.3 方法
1.3.1 采集水樣：用滅菌的吸量管采集水樣。每個水體中采5個水樣，每個水樣采集點之間的距離超過100 m，每個水樣采集10 ml，并記錄水溫。
1.3.2 檢測水樣菌落形成單位(CFU)以及氨芐青霉素耐藥率： 稀釋水樣至1∶10和1∶100,將稀釋的水樣分別培養(yǎng)到LB瓊脂和氨芐青霉素(終濃度60 μg/ml)+LB瓊脂培養(yǎng)基中(每個培養(yǎng)皿中0?1 ml的稀釋后水樣)，然后在37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后分別計數(shù)每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)目(采用柯達電子成像和分析系統(tǒng)120攝像后用Gelpro Analyzer 4?0自動計數(shù))。
1.3.3 KB法藥敏實驗：將耐氨芐青霉素組的菌株進行純培養(yǎng)(37 ℃，氨芐青霉素+LB瓊脂培養(yǎng)基中24 h)，之后從每個培養(yǎng)皿中挑取兩個遠離的菌落各自放入盛有3 ml 氨芐青霉素+MH肉湯的試管中，在37 ℃的搖床中搖約3 h。從每個試管中取1 ml菌液，用生理鹽水稀釋至0?5 MacFarland標(biāo)準(zhǔn)濁度;另外的2 ml菌液繼續(xù)在37 ℃搖床中培養(yǎng)過夜。用棉簽將稀釋的菌液涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，美國NCCLS藥敏實驗紙片擴散法[2]對每個菌株進行藥敏實驗。實驗采用的抗生素有氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、左氧氟沙星、西拉司丁鈉。
1.3.4 酶切質(zhì)粒譜分析：將過夜培養(yǎng)的菌株用堿裂法制備少量質(zhì)粒DNA[3]，將質(zhì)粒用EcorI酶切后在0.7%凝膠瓊脂糖平板上加樣電泳[4]，以1 kb Gene Ladder作為標(biāo)準(zhǔn)，10 V/cm穩(wěn)壓電泳1 h，在柯達凝膠成像系統(tǒng)中攝影后，獲取照片后使用Gelpro Analyzer 4?0 分析。
2 結(jié)果
2.1 水樣CFU以及氨芐青霉素耐藥率 從4個水體中采集到的20個水樣中細菌CFU和氨芐青霉素耐藥率見表1，從表中我們可以看到4個水體中的細菌CFU已經(jīng)較高，而且細菌對氨芐青霉素的耐藥率也相當(dāng)高。
表1 水體中細菌CFU和氨芐青霉素耐藥率水體nalogCFU/mlb氨芐青霉素耐藥率(略)
2.2 藥敏試驗 通過紙片法藥敏實驗得到的氨芐青霉素耐藥菌株對其它抗生素的耐藥譜見表2。從表2中我們看到不同細菌對多種抗生素具有耐藥性，而未發(fā)現(xiàn)作為碳青霉烯類的西拉司丁鈉有耐藥菌株。
表2 氨芐青霉素耐藥菌株對其它抗生素的耐藥性水體測試 略
2.3 酶切質(zhì)粒譜 我們把提取的15個質(zhì)粒樣本經(jīng)EcorI酶切電泳后得到14個條帶，質(zhì)粒檢出率為93?3%。由于采用了1 kb Gene Ladder作為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過EcorI酶切電泳得到的膠帶攝片后經(jīng)過Gelpro Analyzer 4?0分析，找到815 bp~12?2 kb的63種大小不等的酶切片斷，質(zhì)粒最少具有3個酶切片斷，最多具有10個酶切片斷。其中13個質(zhì)粒具有12?2 kb片斷，10個質(zhì)粒具有12?1 kb酶切片斷，9個質(zhì)粒具有10?5 kb酶切片斷，4個質(zhì)粒含有8?9 kb酶切片斷。
3 討論
從我們所調(diào)查的4個水體來看，除中海外,濱州市地面水體中細菌含量偏高，而且細菌存在對氨芐青霉素等常用抗生素的廣泛耐藥，這個與國內(nèi)普遍存在的醫(yī)療單位和養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素現(xiàn)象不無關(guān)系[5]。國內(nèi)外很多資料顯示在河流[6]、下水道[7]、屠宰場[8]和魚[9]、家禽等體內(nèi)普遍存在耐藥性細菌。耐藥性產(chǎn)生的直接后果是嚴重影響了臨床療效，增加了治療成本，同時縮短新藥的應(yīng)用周期，增大了新藥的研究與開發(fā)成本，尤其在人畜同藥的情況下，耐藥性通過畜產(chǎn)品以及環(huán)境等途徑引起的交叉?zhèn)鞑�，直接對人體健康構(gòu)成威脅。因而，細菌耐藥性問題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。從目前的研究來看，細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的機制主要有以下幾個方面[10]：①產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，使抗生素在達到作用部位前即被破壞或失活。②細菌改變細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)，使細胞膜的通透性發(fā)生變化，使抗生素?zé)o法進入細胞內(nèi)到達作用部位而不能發(fā)揮抗菌效能。③改變靶位,使不易為抗生素所作用。如細菌改變青霉素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白減少與 β內(nèi)酰胺類抗生素的親合力而耐藥。④細菌還可通過提高生物合成抗生素拮抗物的量而耐藥。細菌的耐藥基因可以通過染色體介導(dǎo)，更重要的是可以通過質(zhì)粒介導(dǎo)。
耐藥質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、易位或轉(zhuǎn)座等方式在微生物間轉(zhuǎn)移造成耐藥因子增多，從而不但可以在同種間傳播，而且可以在不同種及非致病菌間傳播，造成院內(nèi)和院外感染流行，大大增加細菌耐藥問題的嚴重性。在實驗中我們也發(fā)現(xiàn)很多細菌具有多重耐藥性，即一種細菌具有對多種不同類型的抗生素具有耐藥性。關(guān)于產(chǎn)生多重耐藥性的機制，過去一般認為細菌產(chǎn)生耐藥性與抗菌藥的結(jié)構(gòu)和作用機制有關(guān),并通過質(zhì)粒攜帶的耐藥基因擴散耐藥性，同類結(jié)構(gòu)藥物或作用機制相似的藥物具有部分或全部交叉耐藥性。然而,近幾年隨著分子生物學(xué)手段的不斷應(yīng)用，人們開始從三個層面來認識細菌的耐藥性，上述的細菌耐藥機制可作為第一層面;第二層面則是由于細菌長期接觸藥物，引起菌體細胞膜孔蛋白的丟失，從而導(dǎo)致細胞膜通透性下降，引起低度耐藥;而第三層面則是細菌細胞膜上的外排泵(主動外排系統(tǒng))的表達水平不斷提高，能主動將擴散入細菌細胞內(nèi)的藥物或其它底物泵出細胞外，從而使細菌獲得耐藥性。細菌細胞膜的通透性下降僅能引起低度耐藥性,細菌形成多重耐藥性主要與細菌中存在的外排泵有關(guān)[10]。二者所產(chǎn)生的協(xié)同作用使細菌產(chǎn)生了對多種抗菌藥的高度耐藥性即高水平的多重耐藥性。從酶切質(zhì)粒譜結(jié)果來看，我們發(fā)現(xiàn)在耐氨芐青霉素菌株中12.2 kb的酶切片斷和12.1 kb的酶切片斷大量存在，這些片斷可能與細菌耐氨芐青霉素的特性存在一定聯(lián)系，而更明確的耐藥譜與質(zhì)粒譜之間的關(guān)系，尚需進一步研究。本實驗結(jié)果是具有局限性的[11]，它僅僅代表一部分可以在有氧環(huán)境和特定培養(yǎng)基中生長的細菌，那些未被培養(yǎng)出來的細菌同樣可能具有一定的耐藥性，而且其也可能作為耐藥基因的載體而傳播細菌的耐藥性。
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